米糠和乳酸菌制劑對檸條錦雞兒青貯發酵品質及微生物多樣性的影響

張 歡 朱鴻福 閆艷紅 張桂杰*

(1.寧夏大學動物科學系，銀川750021；2.寧夏草牧業工程技術研究中心，銀川750021；3.四川農業大學動物科技學院，成都611130)

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)是一類廣泛種植于干旱和半干旱地區的防風固沙類豆科灌木，由于大量人工種植的檸條錦雞兒與其他植物競爭土壤養分，從而導致植物物種多樣性降低[1-2]。截止2018年，寧夏鹽池縣檸條面積達1.73萬hm2，生物貯量為59.7萬t[3]。不及時平茬更新使檸條錦雞兒老化和退化現象嚴重[4]，造成大量資源浪費。因此，合理有效利用檸條錦雞兒可減少物種競爭，提高生態系統穩定性。

檸條錦雞兒富含蛋白質、礦物質、維生素和動物生長所需氨基酸[5]，是良好的非常規飼料資源。木質化程度高是制約檸條錦雞兒作為飼料資源開發的重要因素，適宜的加工方式有利于降低其纖維含量。研究表明，花期收獲的檸條錦雞兒營養價值較高，采用揉碎的加工方式可提高其適口性[5-6]。此外，青貯能有效保存檸條錦雞兒營養成分，軟化托葉刺[7]，是保存灌木飼料和緩解干旱地區飼料短缺的貯存方法之一。豆科植物發酵品質不佳主要原因為附著乳酸菌數量少、可溶性碳水化合物含量低和緩沖能值高等自身特性[8]。因此，添加乳酸菌制劑和富含可溶性碳水化合物的農副產物是解決灌木青貯飼料發酵不良的有效途徑之一。

通常情況下，優質青貯飼料要求飼草表面附著乳酸菌數量達到或超過105CFU/g(鮮重)，外源性添加乳酸菌制劑能滿足豆科飼草青貯初期發酵所需乳酸菌數量。目前，外源性添加乳酸菌制劑已成為改善發酵品質方法之一[9]。Yan等[10]從我國南方高水分玉米青貯飼料中分離得到植物乳桿菌LP694，該菌株抗逆性強，產乳酸效率高，可降低意大利黑麥草青貯飼料纖維含量。米糠(rice bran，RB)是稻谷加工副產品，年產量約為2 000萬t，其中約70%用作動物飼料[11-12]。有研究表明，米糠作為碳源可促進乳酸菌生長，提高青貯飼料乳酸含量[13-14]?；诖?，我們推測米糠通過促進乳酸菌生長繁殖從而抑制青貯飼料中不良微生物活動來提高青貯質量。因此，本試驗以花期刈割的揉絲檸條錦雞兒為原料，以米糠、商業植物乳桿菌和植物乳桿菌LP694為青貯飼料添加劑，旨在比較米糠和不同乳酸菌制劑對檸條錦雞兒青貯的發酵品質及微生物多樣性的影響，以期為開發非常規飼料資源檸條錦雞兒提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取種植年限為5年的檸條錦雞兒，2019年5月4日盛花期收獲于寧夏鹽池人工檸條林，立即揉絲，運回實驗室備用。同時，采取300 g檸條錦雞兒樣品裝入液氮罐以備測定其營養成分及微生物多樣性。米糠購于寧夏某科技實業有限公司，商業植物乳桿菌制劑購于天津某有限公司，植物乳桿菌LP694(保藏編號為CGMCC No.15073)由四川農業大學提供。檸條錦雞兒和米糠的營養成分如表1所示。

表1 檸條錦雞兒和米糠的營養成分(干物質基礎)

1.2 試驗設計

以花期檸條錦雞兒為青貯原料，共設4個處理，分別為無添加(對照組)、添加5%米糠(RB組)、添加5%米糠+105CFU/g商業植物乳桿菌(RB+LP組)和添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694(RB+LP694組)。

檸條錦雞兒水分含量采用Aurora型手持式近紅外光譜儀測定，通過添加水將其水分含量調制為60%左右時按照上述進行處理。通過平板計數法測定商業乳桿菌和植物乳桿菌LP694活菌數量，將2種乳酸菌制劑稀釋至105CFU/g。每組4個重復，每個重復稱取500 g左右調制好的樣品裝入青貯袋(30 cm×20 cm)中，真空封口機封口，置于室溫貯存60 d。青貯60 d后測定營養成分、發酵特性及微生物多樣性。

1.3 指標測定

1.3.1 營養成分和發酵特性測定

取200 g檸條錦雞兒原料及其青貯飼料樣品于105 ℃殺青30 min，65 ℃烘箱烘48 h至恒重，測定干物質(dry matter，DM)含量，粉碎后過2 mm篩進行化學分析。中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白質(crude protein，CP)和總氮(total nitrogen，TN)含量測定參照張麗英[15]，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)含量測定參照李富國[16]。

取10 g檸條錦雞兒青貯樣品于90 mL蒸餾水中勻漿1 min，經4層紗布和雙層濾紙過濾后獲得青貯飼料浸提液，-20 ℃保存。分別用pH計(雷磁PHS-3G，上海儀電科學儀器股份有限公司)、苯酚-次氯酸鈉比色法[17]、乳酸測試盒(A019-2-1型，乳酸脫氫酶法，南京建成生物工程研究所)和氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)測定pH及氨態氮(NH3-N)、乳酸、乙酸含量。

1.3.2 微生物多樣性測定

使用FastDNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals公司，美國)試劑盒提取樣品中細菌總DNA。選用細菌16S rRNA的V3～V4可變區338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對所提取的DNA模板進行PCR擴增。使用Illumina MiSeq測序平臺(Illumina公司，美國)進行測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 數據處理

采用JMP軟件通過擬合最小二乘法進行方差分析，組間差異利用Tukey HSD法進行多重比較，數據用平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。使用Uparse軟件對有效序列進行操作分類單元(OTU)聚類(相似度97%以上)，利用RDP classifier比對Silva數據庫(SSU132)對每條序列進行物種分類注釋，設置比對閾值為70%。采用Mothur軟件平臺進行Alpha多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 檸條錦雞兒青貯營養成分及發酵特性分析

如表2所示，與對照組相比，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中NDF和ADF含量均顯著降低(P<0.05)，RB和RB+LP694組青貯飼料中pH顯著降低(P<0.05)，RB+LP694組青貯飼料中NH3-N/TN顯著降低(P<0.05)，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中乳酸含量及乳酸/乙酸均顯著提高(P<0.05)，RB和RB+LP694組青貯飼料中乙酸含量顯著降低(P<0.05)，RB和RB+LP組青貯飼料中丙酸含量顯著提高(P<0.05)。各組之間青貯飼料中干物質和粗蛋白質含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 檸條錦雞兒青貯營養成分及發酵特性(干物質基礎)

2.2 檸條錦雞兒青貯微生物Alpha多樣性分析

如表3所示，各組Coverage指數均在0.99以上，表明測序結果足以反映樣本中絕大部分微生物物種信息。RB+LP組Shannon指數和Chao1指數顯著高于對照、RB和RB+LP694組(P<0.05)，而RB+LP694組Chao1指數顯著低于RB組(P<0.05)。上述結果說明不同添加劑處理影響了檸條錦雞兒青貯微生物群落多樣性。

表3 Alpha多樣性指數

2.3 檸條錦雞兒青貯微生物Beta多樣性分析

檸條錦雞兒青貯主坐標分析(PCoA)如圖1所示，檸條錦雞兒原料及其青貯飼料在圖中有明顯分離，不同添加劑處理的青貯飼料之間亦有明顯分離，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解釋度分別占總方差的64.13%和16.76%。

FM：檸條錦雞兒原料 Caragana korshinskii raw material；Con：對照組 control group；RB：RB組 RB group；RB+LP：RB+LP組 RB+LP group；RB+LP694：RB+LP694組 RB+LP694 group。圖2同 the same as Fig.2。

2.4 檸條錦雞兒青貯微生物相對豐度分析

基于門水平下檸條錦雞兒青貯前后微生物組成如圖2-A所示，檸條錦雞兒青貯原料中優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria，54.50%)、放線菌門(Actinobacteria，30.06%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，9.57%)和厚壁菌門(Firmicutes，3.26%)。青貯60 d后，各組青貯飼料中優勢菌門均為厚壁菌門，其次為變形菌門。對照、RB、RB+LP和RB+LP694組厚壁菌門相對豐度分別為73.02%、94.80%、68.81%和98.99%，變形菌門相對豐度分別為26.90%、4.82%、28.74%和0.96%。其中，RB+LP組中還含有相對豐度分別為1.45%和0.66%的放線菌門和擬桿菌門。

圖2 基于門水平(A)和屬水平(B)的檸條錦雞兒青貯微生物相對豐度

基于屬水平下檸條錦雞兒青貯前后微生物組成如圖2-B所示，檸條錦雞兒青貯原料中優勢菌屬為紅球菌屬(Rhodococcus，13.73%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，12.70%)、泛菌屬(Pantoea，7.09%)、薄層菌屬(Hymenobacter，7.06%)、伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，2.37%)和大量其他菌屬(56.23%)。青貯60 d后，各組青貯飼料中優勢菌屬均為乳桿菌屬(Lactobacillus)。對照組中相對豐度較高的菌屬為乳桿菌屬(71.85%)、腸桿菌屬(Enteobacter，19.62%)及未分類腸桿菌科(unclassfied_f_Enterobacteriaceae，6.98%)；RB組中相對豐度較高的菌屬為乳桿菌屬(91.81%)、醋桿菌屬(Acetobacter，1.84%)、伯克氏菌屬(1.18%)及片球菌屬(Pediococcus，1.23%)；RB+LP組中微生物種類較多，乳桿菌屬相對豐度僅占38.61%；RB+LP694組中乳桿菌相對豐度高達98.88%。

2.5 檸條錦雞兒青貯微生物群落與發酵品質之間的相關性分析

如圖3所示，醋桿菌屬相對豐度與中性洗滌纖維(r=-0.68)和酸性洗滌纖維含量(r=-0.73)呈顯著負相關(P<0.05)，伯克氏菌屬相對豐度與中性洗滌纖維(r=-0.66)和酸性洗滌纖維相對豐度(r=-0.66)也呈顯著負相關(P<0.05)。pH與乳桿菌屬相對豐度呈極顯著負相關(r=-0.75，P<0.01)，與腸球菌屬(Enterococcus，r=0.78)、腸桿菌屬(r=0.85)和未分類腸桿菌科相對豐度(r=0.80)呈極顯著正相關(P<0.01)。乙酸含量與腸桿菌屬(r=0.65)和未分類腸桿菌科相對豐度(r=0.68)呈顯著正相關(P<0.05)。

LA：乳酸 lactic acid；PA：丙酸 propionic acid；NDF：中性洗滌纖維 neutral detergent fiber；ADF：酸性洗滌纖維 acid detergent fiber；AA：乙酸 acetic acid；NH3-N：氨態氮 ammonia nitrogen。

3 討 論

3.1 不同添加劑處理對檸條錦雞兒青貯營養成分及發酵特性的影響

青貯原料特性是影響青貯發酵質量的重要因素。因檸條錦雞兒為豆科灌木，具有WSC含量低、CP含量和緩沖能高的特性，因而單獨青貯較難成功。本試驗中，與對照組相比，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中NDF和ADF含量均顯著降低。RB+LP和RB+LP694組中纖維含量較低的原因可能是青貯發酵過程中微生物產生纖維溶解酶所致[10]。低pH有利于抑制青貯飼料中蛋白酶活性，從而降低NH3-N含量和蛋白質分解程度[18]。本試驗中，CON和RB+LP組青貯飼料中pH較高，故NH3-N含量較高。而RB和RB+LP694組青貯飼料中pH較低，抑制了青貯飼料在發酵過程中的蛋白質降解，故NH3-N含量較低。乳酸/乙酸能反映青貯同型發酵程度，同型發酵程度越高越有利于降低青貯飼料pH。RB和RB+LP694組青貯飼料中乙酸含量低，乳酸含量和乳酸/乙酸高，同型發酵程度較高。張增欣等[19]通過研究丙酸對多花黑麥草青貯動態發酵影響得出，丙酸會通過抑制青貯初期某些不耐酸的乳酸菌來促進某些耐酸性的乳酸菌生長。本試驗中，RB+LP組青貯飼料中丙酸含量較高，表明丙酸對該組中添加的商業植物乳桿菌具有抑制作用，從而導致青貯pH較高。綜合營養成分和發酵特性來看，RB+LP694組青貯飼料具有較好的發酵品質。

3.2 不同添加劑處理對檸條錦雞兒青貯微生物多樣性的影響

Shannon指數和Chao1指數分別反映樣品微生物多樣性和豐富度[10]。Shannon指數越大表明微生物多樣性越高，Chao指數越大表明微生物豐富度越高。本試驗結果表明，添加米糠可降低檸條錦雞兒青貯微生物多樣性，并增加乳桿菌屬相對豐度。這是因為米糠具有相對豐富的WSC含量，促進乳酸發酵，抑制不良微生物增殖[20]。RB+LP694組檸條錦雞兒青貯微生物多樣性和豐富度降低是因為外源性添加的植物乳桿菌LP694成為優勢菌屬，抑制了其他微生物生長繁殖。RB+LP組檸條錦雞兒青貯微生物多樣性和豐富度提高，可能是因為商業乳桿菌未能在青貯初期快速降低青貯飼料pH，較高pH環境下適宜大量微生物生長繁殖。通過PCoA可知，檸條錦雞兒原料及其青貯飼料之間微生物群落具有差異性，不同添加劑使得微生物群落發生了變化。

3.3 檸條錦雞兒青貯微生物群落與發酵品質之間的相關性

有研究表明，厭氧環境導致青貯微生物群落由變形菌門演替為厚壁菌門[21]。本試驗結果表明，變形菌門是檸條錦雞兒原料微生物群落的優勢菌門，而青貯后微生物群落的優勢菌門為厚壁菌門。變形菌門微生物為革蘭氏陰性菌，與乳酸菌競爭利用WSC，導致青貯飼料中NH3-N含量增加[22]。厚壁菌門是革蘭氏陽性菌，可以降解淀粉、蛋白質和纖維素等許多大分子化合物[23]。青貯發酵后變形菌門相對豐度的減少和厚壁菌門相對豐度的增加可能是導致RB和RB+LP694組青貯飼料中NDF、ADF和NH3-N含量減少的原因。

醋桿菌屬微生物產乙酸，能夠引發青貯有氧劣化[24]。醋酸菌(Acetobacteraceti)適宜生長于pH約為7.0的環境條件下，抑制乳酸菌生長后主導青貯發酵，從而形成富含醋酸菌的青貯飼料[25]，這可能是導致RB+LP組pH較高的原因之一。然而，Wang[26]等認為醋桿菌屬微生物并不會影響青貯飼料pH，可能與微生物種類有關。因此，關注種水平下醋桿菌尤為重要。眾所周知，乳桿菌屬微生物在青貯過程中占主導地位，對青貯飼料pH的降低起著重要作用[27]。乳桿菌屬是檸條錦雞兒青貯中優勢菌屬，RB+LP694和RB組中的乳桿菌屬相對豐度較高，其中，RB+LP694組中乳桿菌屬為檸條錦雞兒青貯中占絕對優勢菌屬。這表明米糠可為檸條錦雞兒青貯中乳酸菌繁殖提供發酵基質，使外源添加的植物乳桿菌LP694更適宜在檸條錦雞兒青貯中生長。然而，RB+LP組中乳桿菌屬相對豐度較低，且含有醋桿菌屬和未分類腸桿菌科，表明商業乳桿菌不適宜做檸條錦雞兒青貯添加劑。對于青貯飼料而言，原料中附生微生物不僅在青貯飼料自然發酵中發揮重要作用，而且由于微生物生態系統中營養物質的競爭或相互作用，將影響外源接種劑的有效性。

通過Spearman相關性分析可知，腸桿菌屬及未分類腸桿菌科相對豐度與pH和乙酸含量呈正相關。本試驗中，對照組中含有較高相對豐度的腸桿菌屬和未分類腸桿菌科，RB+LP組中含有較高相對豐度的未分類腸桿菌科，因而二者發酵品質不佳。這是因為不良微生物腸桿菌在青貯飼料中雖然是非致病菌，但其在發酵初期與乳酸菌競爭WSC，青貯pH降低緩慢，產生NH3-N和乙酸等產物[28-29]。本研究結果表明，乳桿菌屬相對豐度與pH呈負相關，這與趙嫚等[30]研究結果一致。RB+LP694組中乳桿菌屬占絕對主導地位，因而青貯pH最低，發酵品質相對更好。此外，醋桿菌屬、伯克氏菌屬相對豐度與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量呈負相關，說明這2種菌屬的微生物在檸條錦雞兒青貯發酵過程中在降低纖維含量方面可能發揮了重要的作用，在后續研究中應予以重視。

4 結 論

① 從發酵品質來看，添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694比添加5%米糠在降低檸條錦雞兒青貯的pH和NH3-N含量、提高乳酸含量和乳酸/乙酸方面效果更佳，添加5%米糠+105CFU/g商業植物乳桿菌對發酵品質改善效果較差。

② 不同添加劑改變了檸條錦雞兒青貯的微生物組成，添加5%米糠和5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694增加了厚壁菌門和乳桿菌屬相對豐度，并降低了變形菌門和腸桿菌屬相對豐度，而添加5%米糠+105CFU/g商業植物乳桿菌則降低了乳桿菌屬相對豐度。

③ 本試驗中，綜合發酵品質和微生物組成，檸條錦雞兒青貯時添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694效果最好。