牛印記基因的研究進展

王丁香，趙紅波

(1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712000；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，濟南 250000)

基因組印記是來自父方和母方的等位基因通過精子和卵子傳遞給子代時發生DNA甲基化和組蛋白乙?；刃揎?，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達特性，是一種不遵循孟德爾定律的遺傳學現象。印記基因在染色體上呈簇狀分布且高度保守。目前，印記基因的研究主要集中在人和小鼠中，被鑒定的印記基因超過200個，而牛上印記基因的研究相對較少。本研究概括了印記基因的特點及其對牛生長發育的影響，以期為牛的印記基因研究提供參考。

1 牛印記基因表達的特點

印記基因主要特點可以概括為：(1)單等位基因表達，相鄰基因具有相反印記作用模式。(2)富含CpG島，易于被高度甲基化修飾。(3)成簇排列，具有差異甲基化區。鄰近的兩個基因在印記簇中心往往交互印記。(4)大多通用，即在鼠中發現的印記基因大部分在其它哺乳動物也表現出印記特征。(5)與個體發育階段密切相關。(6)具有組織特異性，即基因只在特定的組織表現出印記作用。(7)與胚胎生長發育及胎盤的功能有關，一般父源基因表達促進生長，母源基因表達抑制生長。因此，印記基因對動物的生長發育至關重要。

1.1 通過單等位基因的表達鑒定印記基因

當基因在組織中被檢測到呈現單等位基因表達時，就可以確定該基因在組織中是印記基因，相反，當基因呈現非單等位基因表達時，則該基因為非印記基因。印記基因鑒定的主要方法就是核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測。Li等人發現環指蛋白3(makorinringfingerprotein3，MKRN3)、黑色素瘤抗原樣基因2(melanomaantigen-likegene2，MAGEL2)和黑色素瘤抗原(Necdin，NDN)基因在牛的組織中呈單等位基因表達[1]。Dong等人發現重組人RWD域蛋白(impactRWDdomainprotein，IMPACT)和氧固醇結合蛋白樣蛋白1A(oxysterolbindingprotein-like1A，OSBPL1A)基因在牛成年組織中均呈亞型特異性單等位基因表達[2]。Chen等人鑒定了牛Prader-Willi綜合征區域的印跡基因(imprintedgeneinthePrader-Willisyndromeregion，IPW)的同源序列及其在多個組織的表達模式，發現IPW呈單等位基因表達[3]。楊文志通過反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)克隆并分析了位于MEG8與MEG9基因間的2組表達序列—LINC24062和LINC24063在牛8個組織(心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌、皮下脂肪和大腦)中的表達，發現LINC24062和LINC24063在牛被檢測組織中均呈單等位基因表達[4]。以上研究結果為進一步研究印記基因的功能和分析基因表達調控的分子機理奠定基礎。當基因在組織中被檢測到呈現單等位基因表達時，就可以確定該基因在組織中是印記基因，相反，當基因呈現非單等位基因表達時，則該基因為非印記基因。王冠楠等人發現接頭蛋白(Grb2-associatedbindingprotein1，GAB1)和蛋白編碼基因(Scm-likewithfourmbtdomains2，SFMBT2)基因在被檢測的7個組織中均呈雙等位基因表達，表明這兩個基因是非印記基因[5]。

1.2 印記基因的組織特異性

印記基因在不同組織中的表達狀態可能存在差異。Xu等人發現了多個牛印記基因在不同組織中呈現不同的表達狀態。受體酪氨酸激酶基因(Anexelekto，AXL)在4個成年牛組織(心臟、肝臟、脾臟和脂肪)中呈單等位表達，而在其他組織(如肺、腎、肌肉、腦和胎盤)中呈雙等位表達[6]。而溶質載體家族38成員4(solutecarrierfamily38member4，SLC38A4)基因在成年牛心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦等8個組織中都沒有印記，但SLC38A4在5個異質胎盤中呈多態性狀態，其中3個呈父系單等位表達，2個呈雙等位表達，除了DNA甲基化之外，還有其他表觀遺傳學特征在調節牛SLC38A4的印記表達[7]。

1.3 印記基因在不同動物間的比較研究

目前已有研究證明，印記基因在不同物種間可能表現出相同的印記狀態，對物種間印記基因的比較分析有助于研究基因組印記的生物學意義和調控機制。趙姝君等人分析了含PH同源域蛋白家族A成員2(pleckstrinhomology-likedomainfamilyAmember2，PHLDA2)在成年牛組織中的表達狀態，結果表明PHLDA2基因在牛的心、肝、脾、肺、腎、大腦、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盤10個組織中均呈單等位基因表達[8]。這與人、鼠和豬中PHLDA2基因表達模式相同，即均是母源表達的印記基因。Khatib對神經內分泌蛋白(Neuroendocrinesecretoryprotein55，NESP55)基因多態性位點進行檢測，發現了NESP55基因外顯子在各組織中的轉錄本均呈單等位基因表達，這與小鼠、人類的表達模式相同[9]。另外Khatib基于多態性的方法對比研究蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)基因在人、羊和牛中的表達狀態，發現該基因在各物種的組織均呈散在型的復雜表達模式，即在某些組織中優先表達單等位基因表達，在其他組織中優先雙等位基因表達[10]。

1.4 印記基因在胚胎發育各階段的特異性表達

印記基因在胚胎發育各階段呈特異性表達。趙德超等人檢測到黑色素瘤抗原基因2(melanomaantigen-likegene2，MAGEL2)、肌糖(sarcoglycanepsilon，SGCE)和小核內核糖核蛋白(Smallnuclearribonucleoprotein-associatedproteinN，SNRPN)這3個母源性基因在體外受精(In vitro Fertilization，IVF)各階段的胚胎中都有表達，但MAGEL2基因在牛孤雌激活(Parthenogenetic Activation，PA)胚胎中不表達；SGCE基因在PA胚胎的2～4細胞階段表達，在其他發育階段均不表達；SNRPN基因在PA胚胎的2細胞和囊胚階段的表達水平較低[11]。牛IGF2基因座是由5個啟動子(P0、P1、P2、P3和P4)控制的具有不同轉錄本的基因組區域。轉錄調節可以影響mRNA的穩定性和翻譯，從而影響隨后的生物學效應。Willhelm等人評估了牛IGF2基因啟動子特異性表達模式，結果表明，P0、P1和P2在早期階段起次要作用，P3與后期的發育相關，P4是牛卵母細胞成熟和胚胎發育過程中IGF2表達的主要途徑。因此，在胚胎生長和發育生物學研究中，P4是影響體外生長胚胎(In vitro production of embryos，IVP)的主要靶點[12]。

1.5 胚胎發育中印記基因的父系表達和母系表達

胚胎發育過程中印記基因有父系表達和母系表達兩種表達方式。Gu等人檢測了鋅指蛋白597(ZincFingerProtein597，ZNF597)在成年牛胎盤組織和體細胞中的等位基因表達情況，結果發現ZNF597基因是在胎盤和包括大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和肌肉的其他7個組織中均呈單等位表達的母系表達基因[13]。Liu等人研究發現胰島素樣生長因子Ⅱ受體(insulin-likegrowthfactorⅡreceptor，IGF2R)、反義RNA(antisenseRNA，AIR)和神經元外單胺轉運蛋白成員3(extraneuronalmonoaminetransportermember3，SLC22A3)基因在牛心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉、脂肪和大腦等8個組織中均呈單等位基因表達的；在胎盤中，IGF2R和SLC22A3基因呈母系表達，而AIR基因呈父系表達[14]。

2 印記基因的表達調控研究

2.1 基因印記位點的DNA甲基化與細胞重編程

DNA的異常甲基化會造成印記基因表達紊亂，從而影響器官的正常發育，這可能是導致克隆效率低下和克隆動物器官發育異常的主要原因之一。

2.1.1 甲基化參與印記基因的調控 DNA甲基化調節許多生物過程，如基因組印記、X染色體失活和轉座子沉默。此外它在配子發生和胚胎發育中起著至關重要的作用。印記基因通常在染色體上呈簇狀出現，并由涉及差異DNA甲基化修飾的順式印記控制區進行調節。Wang等人發現印記基因抗體周期蛋白依賴激酶抑制因子1C抗原(cyclin-dependentkinaseinhibitor1C，CDKN1C)在牛的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉和皮下脂肪中呈單等位基因表達，另外在在肝、脾和肺3個組織中分析了差異甲基化區域(Differentially methylated region，DMR)—CDKN1CDMR和KVDMR1 DMR的特異性甲基化模式。結果表明，在CDKN1CDMR中，3個組織中2個親本等位基因均未發生甲基化，而相同組織中KVDMR1 DMR，2個親本等位基因的甲基化水平存在顯著差異，證明該區域為KVDMR1的DMR，這表明在3個組織中，KVDMR1區域的DNA甲基化可能在調節牛的CDKN1C基因的印記表達方面發揮了重要作用[15]。Mendon?a等人研究發現，與完全體內產生的胚胎相比，體外胚胎中的IGF2基因DNA甲基化水平更高，且雄性體外胚胎中的DNA甲基化水平較雌性更高[16]。王巍的研究表明H19-IGF2基因簇呈父系印記，其印記控制區(imprinting control regions，ICRs)在父系染色體呈甲基化狀態并且隨父源基因組一起經歷甲基化的消除和重建，因此該ICR區在早期胚胎發育過程中的甲基化變化情況能夠間接的反映父系DNA的甲基化動態變化模式[17]。同理PWS/AS基因簇的ICR區(PWS-IC)呈母系印記狀態，其ICR區在早期胚胎發育過程中的甲基化變化模式可以反映母系染色體的甲基化模式。Lafontaine等發現胰島素樣生長因子2(insulin-likegrowthfactor2，IGF2R)、小核核糖核蛋白多肽N(smallnuclearribonucleoproteinpolypeptideN，SNRPN)和肝癌父系高表達基因(paternallyexpressed10，PEG10)等印記基因的甲基化水平受培養條件和胎牛血清的影響，而且供卵細胞的年齡也影響編碼緩慢激活延遲整流鉀通道基因(KQT-likesubfamilymember1，KCNQ1)和多型性腺瘤基因樣蛋白1(pleiomorphicadenomagene-like1，PLAGL1)的甲基化；同時不同的輔助生殖技術也會導致牛胚胎特異性表達印記基因的甲基化[18]。Smith等分析了牛印記基因SNRPN、H19和IGF2R的DMR，發現與體內觀察到的甲基化模式(人工授精)相比，印記等位基因和體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)胚胎的雙等位基因表達普遍存在低甲基化[19]。這些結果表明，在早期發育時體細胞核的重編程過程中印記標記可能被擦除，而且這種表觀遺傳異?？赡芘c克隆動物的死亡率和發病率高有關。

2.1.2 印記基因影響細胞核移植過程中供核細胞的表觀重編程 表觀遺傳重編程在保證機體正常發育和克隆動物的細胞核全能性方面具有重要作用。SCNT已成功用于多種哺乳動物的克隆。馬馨等人研究發現死亡克隆牛胎盤中印記基因H19及肝癌高表達基因抗原(Paternallyexpressedgene10，PEG10)出現超甲基化狀態，推測體細胞核移植過程影響了供核細胞的表觀重編程，并影響胎盤及內臟器官的正常發育[20]。Ma等人發現卵母細胞中轉錄共抑制因子TRIM28的敲除對H19基因的影響最大[21]。進一步的研究表明，TRIM28在卵母細胞成熟期間高度表達，并在2細胞期達到峰值水平；相比之下，這一階段的SCNT胚胎中TRIM28的表達顯著降低，表明在SCNT期間TRIM28轉錄本丟失，并可能導致克隆胚胎無法印記。已知10-11易位3(thatten-eleventranslocation3，TET3)負責牛著床前胚胎發育過程中的DNA去甲基化，Zhang等人在體外構建了過表達TET3的細胞系，發現利用這些成纖維細胞作為供體細胞的囊胚率比SCNT增加了約18%[22]。牛SCNT胚胎中TET3的過表達導致多能性基因NANOG和八聚體結合轉錄因子(Octamer-bindingtranscriptionfactor，OCT-4)的整體DNA甲基化水平的降低和轉錄活性的增加。盡管如此，SCNT胚胎中印記基因H19-IGF2 DMR的DNA甲基化仍然不受TET3過表達的影響，保持了親本特異性活性以供進一步發育，該研究結果實現更高的克隆效率提供了一種有效的方法。

2.1.3 營養水平對印記基因甲基化的影響 孕期母體的營養水平是決定胎兒發育的重要因素，對胎兒印記基因的表達有影響，并可能誘發后代的長期表觀遺傳變化。Wang等人的研究表明孕期母體營養水平與肉牛后代肌肉中印跡基因和DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的差異表達有關[23]。Devos等人的研究結果表明，在安格斯肉牛中，不同的產前營養和RFI遺傳潛力會導致出生后胰島素樣生長因子2(Insulin-likegrowthfactor2，IGF2)和IGF2R甲基化模式的組織特異性改變，而且這些模式也會隨著年齡的變化而變化[24]。Graugnard等人發現對早期斷奶的安格斯牛飼喂高淀粉會引起脂肪生成轉錄調控因子的代謝印記[25]。Paradis等人的研究表明，在妊娠后半期不同營養水平可以改變胎兒肌肉中生長基因，肌源性和脂肪原基因的表達，雖然不會在胎兒表型上產生明顯差異，但這種影響因肌肉功能或纖維而異。另外IGF2甲基化水平的差異以及miRNA表達的差異可能是基因表達差異之前的功能機制，并可能導致跨代表觀遺傳編程[26]。

2.2 特殊基因的印記表達作用

近年來，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)研究領域發展迅速。已知反義lncRNA(antisenseclong non-coding RNAs，antisense lncRNAs)、基因間lncRNA(intergenetic lncRNAs，lincRNA)和增強子lncRNA(enhancer lncRNAs，eRNA)可以調節基因組印記，導致基因呈親本來源特異性的單基因表達。然而，內含子lncRNA(intronic ncRNAs)在基因組印記中的功能尚不清楚。Yang等從MEG8基因的cDNA序列中鑒定出3種新的lncRNAs，分別命名為MEG8內含子RNA1(MEG8-it1)、MEG8內含子RNA 2(MEG8-it2)和MEG8內含子RNA 3(MEG8-it3)，這3個lncRNA與MEG8的表達模式相似，在所有被測的8個牛組織中均呈單等位基因表達，表明它們在牛上是印記的[27]。Choo等人證實了哺乳動物父系表達基因3(paternallyexpressedgene3，PEG3)位點具有反義轉錄基因APEG3，并且呈父系等位基因特異性表達[28]。由于APEG3定位于PEG3基因的3'非翻譯區(untranslated region，UTR)，且APEG3轉錄本可以與PEG3轉錄本互補，因此APEG3更有可能參與PEG3的轉錄后調控，并且對印記區域的功能具有潛在作用。

2.3 基因的異常印記表達與印記障礙

印記基因的異常表達常引發伴有復雜突變和表型缺陷的多種疾病，例如使用輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)孕育的后代通常會得大胎綜合癥(large offspring syndrome，LOS)從而導致牛胎兒過度生長[29]。目前證實ART誘導的LOS是一種印記丟失(loss of imprinting，LOI)的表觀遺傳綜合征，基因印記模式的改變會引起甲基化的改變進而導致印記丟失，從而誘發綜合征。Hori等人在患有LOS的胎兒頸部半透明組織厚度檢查和體外授精(in vitro fertilization，IVF)小牛中研究發現KCNQ1反義轉錄物1(KCNQ1oppositestrand/antisensetranscript1，KCNQLOT1)/周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(cyclin-dependentkinaseinhibitor1C，CDKN1C)基因結構域印記控制區域的異常低甲基化狀態，即KCNQLOT1的雙等位基因表達量增加而CDKN1C的表達量減少，表明牛KCNQLOT1/CDKN1C結構域的異常印記可能會產生ART技術孕育的LOS犢牛[30]。父本泛素蛋白連接酶E3A(ubiquitinproteinligaseE3A，UBE3A)等位基因的沉默被認為是由父本表達的UBE3A-ATS反義RNA轉錄引起的，UBE3A基因的異常印記表達與幾種神經發育綜合征和心理障礙有關[31]。目前已經在小鼠和豬中研究了UBE3A基因的異常印記表達，但在牛中還未有進一步研究。

3 問題與展望

印記基因分為父系印記基因和母系印記基因，它的表達具有組織和胚胎特異性，在胚胎期不同時間段的表達也有一定差異，為深入了解印記基因的調控機制奠定了基礎。DNA甲基化在調控印記基因的表達中起重要作用，而且印記基因在細胞核移植過程影響了供核細胞的表觀重編程，這種表觀遺傳異?？赡茉诳寺游锏乃劳雎屎桶l病率中起關鍵作用，但是具體機制仍需再研究。妊娠特定階段的母體營養水平會導致胎兒和生后發育的重編程，并影響印記基因的甲基化水平，但關于母體飲食對肉牛印記基因表達的影響的現有數據有限。目前在牛中只發現極少印記基因的異常表達和印記障礙。隨著基因組印記相關的表觀遺傳研究越來越深入，將為動物胚胎的生長發育和疾病的調控機制研究提供更多理論依據。