雌馬酚及其對應異構體抑制烏拉坦誘導小鼠肺癌發生率

于 雪，鄒永秋，王 穎，陳澤琨，馬德福

(北京大學公共衛生學院社會醫學與健康教育系，北京 100191)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,根據組織學類型分型，肺癌可以分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)， 其中非小細胞肺癌是肺癌中最常見的類型，約占肺癌的85%[1]。根據國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)2020年發布的報告，在美國所有癌癥中，肺癌的發病率和病死率分別為第2位和第1位，接近四分之一的癌癥患者死于肺癌[2]。在我國，肺癌的發病率呈逐年上升趨勢，1988—2005年間，肺癌發病率的年平均增長為1.63%， 其中男性為1.30%，女性為2.34%[3]。2015年我國肺癌新發病例達73.3萬人，死亡61.0萬人，占所有腫瘤發病和死亡人數的17.1%和21.7%[4]。目前NSCLC患者的治療方案主要包括根治性手術、放化療和分子靶向治療。雖然在手術方式的優化、輔助支持治療和綜合治療方面取得了進展，但是NSCLC患者的預后仍不理想，5年生存率僅約21%[5-6]。藥物化療作為肺癌一種常用治療手段，在中晚期肺癌的治療中發揮著重要的作用，但是NSCLC對傳統治療藥物并不敏感，并且常常出現耐藥[7-8]。因此，尋找對肺癌防治更加有效的方法至關重要。

天然食物及其活性成分在改變肺癌風險中所發揮的作用目前越來越受到研究者重視。大量證據已經證實，水果、蔬菜、豆類及其所含的特定抗氧化劑和活性成分(如植物雌激素)對肺癌具有預防作用[9]。大豆異黃酮是植物雌激素的一種，是大豆生長過程中形成的次生代謝產物，存在游離型的苷元和結合型的糖苷兩種形式，其中苷元主要為染料木素、大豆苷元和黃豆黃素3種。雌馬酚是大豆苷元在體內生物轉化產生的具有較穩定化學結構的代謝產物，是大豆異黃酮及其代謝產物中雌激素樣活性和抗氧化活性最高的一種[10]。與前體物質大豆苷元不同，雌馬酚在呋喃環的C-3位置處有一個手性碳，因此是手性分子，存在R、S兩種對應異構體，體內代謝產物均為S型，人工合成的雌馬酚則為二者混合物，即外消旋雌馬酚。目前雌馬酚(尤其是雌馬酚對應異構體)對肺癌影響的研究較少見，雌馬酚及其對應異構體對肺癌的影響及其機制尚不清楚。本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，探討外消旋雌馬酚及雌馬酚對應異構體對肺癌的影響和其可能機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

酶聯免疫檢測儀購自美國Thermo公司，外消旋雌馬酚及其對應異構體(98%)購自美國LC Laboratories公司，核因子紅系2相關因子2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2]抗體購自美國Abcam公司，β-actin(AC001-M)購自美國Santa Cruz Biotecnology公司，二抗抗體購自愛爾蘭Rockland公司，胰酶、胎牛血清、細胞培養基購自美國Invitrogen公司，蛋白提取、定量及蛋白免疫印跡相關試劑購自美國Bio-rad公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehye, MDA)和8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-hydroxydeoxygunosine, 8-OHdG)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物實驗

5周齡雄性C57BL/6小鼠120只，購自北京維通利華實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證：SCXK(京)2016-0006]，飼養于北京大學醫學部實驗動物科學部SPF級動物實驗室。實驗室溫度(23±2)℃，濕度50%±5%，通風良好，光線12 h明暗交替，動物自由飲水和攝取配方飼料。采用改良的AIN-93G配方飼料，為了排除飼料中大豆異黃酮的影響，其中的大豆油用玉米油代替。適應性喂養1周后進行動物分組，同時進行肺癌的造模。本研究開始前獲得北京大學生物醫學倫理委員會審查批準(LA2020048)。

120只小鼠隨機分為8組(表1)，每組15只，分別為肺癌腫瘤對照組(control group, CG組)、染料木素對照組(genistein control group, GCG)、低劑量外消旋雌馬酚組(low equol group, LEG)、高劑量外消旋雌馬酚組(high equol group, HEG)、低劑量R-雌馬酚組(low R-equol group, LRE)、高劑量R-雌馬酚組(high R-equol group, HRE)、低劑量S-雌馬酚組(low S-equol group, LSE)和高劑量S-雌馬酚組(high S-equol group, HSE)。調整人與嚙齒動物的異速生長比例后，250 mg/kg的雌馬酚與人類從日常大豆食品的攝入量相當[11]。因此，本研究雌馬酚及其對應異構體各設兩個劑量組，即250 mg/kg和500 mg/kg，比較常規大豆飲食和高劑量的雌馬酚對肺癌的影響，設置染料木素組比較雌馬酚及其對應異構體與經典大豆異黃酮對肺癌的影響。

表1 各實驗組飼料成分Table 1 Feed composition of each group

烏拉坦粉末溶于0.9%(質量分數)生理鹽水中，充分振蕩混勻配成4%(質量分數)的烏拉坦溶液，于棕色玻璃瓶中保存。皮下注射方式給與每只小鼠800 mg/kg劑量的烏拉坦溶液，每周2次,連續4周誘導肺癌動物模型。烏拉坦連續注射4周后再繼續喂養4個月(17周)后結束實驗，脫頸椎法處死小鼠。開始實驗的每周第1天及實驗結束當天稱量并記錄小鼠體質量和食物攝入量，觀察小鼠狀態和生長情況。實驗結束時處死解剖小鼠，取肺，肉眼進行初步的腫瘤形態學鑒定，并進行腫瘤取材，經多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟制作病理切片，顯微鏡下核實判斷。記錄各組發生腫瘤的小鼠數，計算各組腫瘤發生率，腫瘤發生率=(各組發生腫瘤的小鼠數/各組小鼠總數)×100%。

1.3 血液氧化/抗氧化指標檢測

實驗結束處死小鼠前對小鼠進行麻醉，使用摘眼球法取血，所得血液立即經離心機3 000 r/min離心15 min，分離出血清，置于-20℃冰箱保存。血清中的SOD、MDA和8-OHdG的含量按照說明書步驟使用相應的試劑盒進行檢測。

1.4 蛋白表達水平的測定

稱量50～100 mg肝左葉組織放在玻璃勻漿器中，加入含有1 mol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethyl-sulfonyl fluorid, PMSF)的細胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min取上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白濃度測定法進行定量。50 μg總蛋白等量上樣，10%(質量分數)的聚丙稀酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉至聚偏氟乙烯膜。5%(質量分數)脫脂奶溶液室溫封閉2 h后，Nrf2和β-actin的一抗抗體用5%脫脂奶稀釋，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液(tris buffered saline，with Tween-20, pH 8.0)漂洗3次后加入二抗，室溫下孵育1 h，使用增強熒光發光試劑顯影，然后使用圖像成像系統檢測條帶。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠體質量和攝食量情況

每組小鼠平均體質量周變化情況如圖1，隨機分組后各組小鼠體質量差異無統計學意義，皮下注射烏拉坦造模期間小鼠體質量呈基本不變或略有下降趨勢，隨后各組小鼠隨時間增加體質量增加?？傮w來看，CG組小鼠體質量最高而LRE和HRE組小鼠體質量較低，但重復測量數據的方差分析發現各組小鼠體質量差異無統計學意義。

CG， control group； GCG， genistein control group； LEG， low equol group； HEG， high equol group； LRE，low R-equol group； HRE， high R-equol group； LSE， low S-equol group； HSE， high S-equol group.圖1 實驗期間小鼠體質量周變化情況Figure 1 Weekly changes in body weight of mice during the experiment

每組小鼠平均食物攝入量周變化如圖2，總體來看，CG組和HEG組小鼠平均食物攝入量較高，而LRE和HRE組較低，且LRE組和HRE組與CG組和HEG組小鼠平均食物攝入量間差異具有統計學意義。

CG，control group；GCG，genistein control group；LEG，low equol group；HEG，high equol group；LRE，low R-equol group；HRE，high R-equol group；LSE，low S-equol group；HSE，high S-equol group.圖2 實驗期間小鼠單位體質量食物攝入量周變化情況Figure 2 Changes in weekly food intake per unit weight of mice in each group

2.2 小鼠肺癌發生情況

烏拉坦致小鼠肺癌切片經HE染色結果發現全部為肺腺癌，誘導時間短且無小鼠死亡。120只小鼠中49只出現肺癌，肺癌總體發生率為40.8%，各組小鼠的肺癌發生情況如表2，CG組肺癌發生率最高為86.7%(13/15)， HRE和HSE組肺癌發生率最低為13.3%(2/15)。與CG組相比，各實驗組肺癌發生率均更低，且差異具有統計學意義。同種藥物高劑量實驗組肺癌發生率顯著低于低劑量實驗組。同等劑量下，3種雌馬酚組小鼠肺癌發生率差異沒有統計學意義，并且與GCG組小鼠肺癌發生率相當。

表2 各組小鼠肺癌發生情況Table 2 The incidence of lung cancer in each group

2.3 氧化/抗氧化指標結果

ELISA檢測各組小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量(表3)發現，與CG組相比，GCG、HRE和HSE組小鼠血清中SOD的含量較高，且差異具有統計學意義；HEG、LRE和LSE組小鼠血清中SOD含量高于CG組，但差異無統計學意義。與CG組相比，LEG組小鼠血清中MDA含量較低，但差異無統計學意義，其余各組小鼠血清中MDA含量均顯著低于CG組，且同種藥物高劑量雌馬酚組小鼠血清中MDA含量顯著低于低劑量雌馬酚組。與CG組相比，LSE組小鼠血清中8-OHdG含量較低，但差異無統計學意義，其余各組小鼠血清中8-OHdG含量均顯著低于CG組，且同種藥物高劑量雌馬酚組小鼠血清中8-OHdG含量顯著低于低劑量雌馬酚組。同等劑量下，3種雌馬酚組小鼠血清中氧化/抗氧化指標差異無統計學意義，并且與GCG組小鼠相當。

表3 各組小鼠血清中氧化/抗氧化指標結果Table 3 The result of oxidation/anti-oxidation indices in serum of each group

為了進一步探討雌馬酚及其對應異構體影響肺癌發生的抗氧化機制，通過Western blotting法檢測了肝組織中Nrf2蛋白的表達(圖3)，發現除LEG組外，其余各組小鼠的Nrf2蛋白表達水平均高于CG組小鼠，并且同種藥物高劑量雌馬酚組的Nrf2蛋白表達水平高于低劑量雌馬酚組。

CG， control group； GCG， genistein control group； LEG， low equol group； HEG， high equol group； LRE， low R-equol group； HRE， high R-equol group； LSE， low S-equol group； HSE， high S-equol group.圖3 各組小鼠Nrf2蛋白的表達情況Figure 3 Nrf2 protein expression profile in each group

3 討論

本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，探討了外消旋雌馬酚及雌馬酚對應異構體對烏拉坦誘導的肺癌發生發展過程影響及其機制，并與經典大豆異黃酮染料木素比較，發現雌馬酚及其對應異構體可能通過上調Nrf2基因的表達，增強小鼠的抗氧化能力，進而降低烏拉坦誘導的肺癌發生率。3種雌馬酚降低肺癌發生率的作用差異無統計學意義，且與同等劑量的染料木素作用相當。

細胞外及細胞內SOD、MDA和8-OhdG的含量可一定程度反映細胞的氧化損傷情況。SOD是機體抗氧化系統中重要的酶類，可以特異性地結合機體內的超氧陰離子，清除自由基，通過阻斷氫原子供體和終止自由基連鎖反應，抑制機體內脂質過氧化反應，起到抗氧化作用。MDA是脂質過氧化的反應終產物，MDA的增加表明組織細胞脂質過氧化產物量的增加，可以間接反映出機體細胞受自由基攻擊的程度。8-OHdG是活性氧自由基氧化損傷細胞核DNA或線粒體DNA后形成的產物，在機體內穩定存在，不會通過非DNA氧化途徑形成，也不再被機體進一步代謝，因此常作為內源性及外源性因素對DNA氧化損傷作用的生物標志物。大豆異黃酮含有多個酚羥基作為配氫體，可以為活性氧自由基提供電子和氫，使這些自由基得以穩定發揮其抗氧化作用[12]。既往研究發現，大豆異黃酮及其代謝產物雌馬酚可降低大鼠血清中8-羥基脫氧鳥苷的含量，增加超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的表達[13-14]。本研究通過測量各組小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量來衡量各組小鼠血液氧化/抗氧化水平，結果表明雌馬酚及其對應異構體可顯著提高小鼠的抗氧化能力，且同種藥物高劑量雌馬酚組的小鼠血清抗氧化水平顯著高于低劑量雌馬酚組，即雌馬酚具有的抗氧化性可能存在一定的劑量反應關系。

Nrf2是細胞調節氧化應激的一種關鍵轉錄因子，通過與抗氧化反應原件結合，啟動下游抗氧化基因的轉錄和表達，進而提高細胞抗氧化能力。有研究報道Nrf2可誘導抗氧化酶的表達來降低肝、肺等組織的氧化損傷，進而發揮其化學防癌的作用[15-16]。本研究測量了各組小鼠Nrf2蛋白的表達，結果表明雌馬酚及其對應異構體可上調小鼠Nrf2蛋白的表達。這些結果與各組小鼠肺癌發生率及血清中氧化/抗氧化相關指標結果一致，提示雌馬酚及其對應異構體可能通過上調Nrf2基因的表達來增強小鼠的抗氧化能力，進而降低了烏拉坦誘導的肺癌發生率。

綜上所述，雌馬酚及其對應異構體可能通過抗氧化效應抑制肺癌的發生，本研究結果為利用雌馬酚，發揮其有益效應，避免其有害影響提供了理論依據。