帶TRS基序突變的新型冠狀病毒威脅更大

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）屬于套式病毒目（）、冠狀病毒科（）、冠狀病毒亞科（）、Beta 冠狀病毒屬的B 亞群（Sarbecovirus）。在本文中，如不特別說明，冠狀病毒特指冠狀病毒亞科。根據國際病毒分類委員會第9次會議報告，冠狀病毒亞科（）分為4個屬，分別是Alpha、Beta、Gamma和Delta冠狀病毒；Beta冠狀病毒屬又再分為5 個亞屬，即Embecovirus、Sarbecovirus、Merbecovirus、Nobecovirus和Hibecovirus，分別對應此前已定義的A、B、C和D4個亞群和一個我們新定義的E亞群。SARS-CoV-2的基因組與其他冠狀病毒基因組結構相似，是一個不分節段的單股正鏈RNA，其12個基因共編碼26個蛋白，其中，ORF1a和ORF1b基因各編碼一個多聚蛋白，這兩個多聚蛋白被切割成16 個成熟蛋白（NSP1-16）以行使功能。此外，SARS-CoV-2基因組還編碼4個結構蛋白（S、E、M和N）和6個輔助蛋白（3a、6、7a、7b、8和10）。

冠狀病毒基因組的復制和轉錄由復制轉錄復合體Replication、transcription complex完成，其核心是RNA依賴型RNA聚合酶（RdRp，也常表示為NSP12）。冠狀病毒，乃至整個套目病毒的一個非常重要的特征就是存在跳躍式轉錄，也稱為不連續轉錄、聚合酶跳躍或模板轉換。跳躍式轉錄的分子機制是一個長期沒有得到解答的科學問題，有研究提出“Leader-body fusion”模型用以解釋跳躍式轉錄，但其分子機制依然未知。直到2021年首次報道了TRS基序是冠狀病毒的尿苷酸特異性RNA 內切酶（NendoU，常表示為NSP15）的酶切位點，NSP15的酶切作用是實現冠狀病毒跳躍式轉錄的分子基礎，并提出了NSP15對冠狀病毒復制和轉錄的負反饋調控模型。由于冠狀病毒的跳躍式轉錄與重組都需要依賴NSP15的酶切作用，即共享一個分子機制，冠狀病毒可在其生存周期中隨時發生重組，成為導致其反復暴發的最主要因素。在隨后的研究中又發現了NSP15蛋白酶切位點與RNA甲基化的相互關系，特別是TRS發卡結構的重要作用，進一步解釋了冠狀病毒復制轉錄復合體的工作原理。TRS基序將冠狀病毒轉錄調控和重組等重要功能聯系到一起，因此，值得深入研究。

本研究報道全部冠狀病毒的TRS基序以及多種SARS-CoV-2突變株已出現TRS基序突變，為深入研究冠狀病毒的爆發、傳播規律以及開發減毒活疫苗等建立了基礎；本研究采用進化與分子功能聯合分析法，分析了TRS 基序突變在冠狀病毒進化中的作用，預測了SARS-CoV-2大流行后期有可能出現帶TRS突變的超級減毒株，并分析了其危害，為大流行后期的防控提供理論依據；帶TRS基序突變的Delta突變株已經在新加坡出現并有擴散趨勢，因此新加坡，甚至東南亞可能形成下一波疫情的傳播中心。

1 材料和方法

1.1 TRS基序的鑒定

從NCBI RefSeq、GenBank和GISAID等數據庫獲取冠狀病毒亞科和環曲病毒亞科所有病毒的基因組序列。將下載的基因組按照亞群分類，使用Clustal W工具進行多重比對，將結構蛋白基因（S、E、M和N）對齊，找出所有5'UTR中以及結構蛋白基因上游的TRS，鑒定每個病毒的TRS-L和TRS-Bs。

1.2 TRS基序突變的監測

通過檢索國家生物信息中心2019新型冠狀病毒信息庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/ncov/），監測TRS-L 中的經典TRS 基序ACGAAC（基因組位置為MN908947：70-75）的突變情況；從GISAID數據庫獲取帶TRS基序突變的SARS-CoV-2的基因組序列，通過Perl腳本編程再次確認TRS基序突變信息并進行統計。

1.3 SARS-CoV-2突變株對中和抗體效力的影響

此外，李白《春思》里的“春風不相識，何事入羅幃？”金昌緒《春怨》中特別口語化生活化的句子“打起黃鶯兒，莫教枝上啼。啼時驚妾夢，不得到遼西”，韓愈《春雪》里“白雪卻嫌春色晚，故穿庭樹作飛花”，岑參《山房春事二首》中“庭樹不知人去盡，春來還發舊時花”，等等。不一而足，都帶給讀者不一樣的審美感受。

2 結果

2.1 冠狀病毒跳躍式轉錄的分子機制

在使用NCBI公開數據進一步驗證NSP15蛋白酶切位點的過程中，我們鑒定了套目下全部病毒的經典TRS基序（圖2），特別是確認了冠狀病毒的經典TRS基序（canonical TRS motif）都是以腺苷酸殘基A開始的含A最多其次是C的一致性序列這一規律。結合進化分析的結果，進一步定義如下：一個冠狀病毒基因組只有一個經典TRS基序（這個TRS基序與該病毒所在類群最早分化出來的祖先的TRS基序最接近），一般情況下，冠狀病毒亞科病毒TRS-L中的TRS基序是經典TRS基序，而TRS-B中的基序可以是經典TRS基序，也可以是非經典TRS基序（non-canonical TRS motif）。非經典TRS基序與經典TRS基序可以有幾個核苷酸殘基的差異，這些差異顯然是來自進化過程中保留下來的突變。

2.2 全部冠狀病毒TRS基序的鑒定

如果RNA合成酶RdRp不間斷地讀取基因組RNA[記做gRNA(+)]，則合成反義基因組RNA[記做gRNA(-)]，如果RdRp在合成過程中遇到基因體轉錄調控序列（TRS-B）時產生跳躍，并將模板轉換為前導轉錄調控序列（TRS-L），則合成產物為反義亞基因組RNA[記做sgRNAs(-)]；RdRp的連續合成完成復制以及ORF1a和1b兩個基因的轉錄，RdRp的不連續合成完成其它10個基因的轉錄，即跳躍式轉錄；RdRp 以gRNAs(-)和sgRNAs(-)為模板分別合成gRNAs(+)和sgRNAs(+)；gRNAs(+)用作ORF1a和ORF1b翻譯的模板，sgRNAs(+)用作其它10種蛋白質翻譯的模板；TRS-L通常由冠狀病毒基因組前60至70個核苷酸殘基（位于5'端非編碼區內）組成，長度不同的TRS-B位于除ORF1a和1b外的其它基因的緊鄰上游，并調控其緊鄰下游的基因；每個冠狀病毒基因組的TRS-L和TRS-B共有一段特定的一致性序列，叫做轉錄調控序列基序，簡稱TRS基序（圖1）。

GISAID數據庫中2020年1月27日～2021年5月6日采樣的29 205條印度地區SARS-CoV-2的基因組幾乎不帶TRS基序突變，特別是在印度早期傳播的毒株中未發現TRS基序突變。因此，我們將EPI_ISL_2508633指定為帶TRS 基序突變的Delta 突變株的參考基因組。新突變株不僅具備Delta突變株的全部特性（如免疫逃逸），而且帶TRS基序突變，可能已是或將發展成為超級減毒株。進一步的研究顯示，在帶TRS基序突變的Delta突變株中，除了RBD結構域中的兩個重要突變L452R（RC6內）和T478K（RC7內），還有最早流行的一個突變D614G；此外，NTD結構域中的RC4重組區有多個突變（G142D、E156G、F157del 和R158del），比RBD結構域變異還要頻繁。

2.3 TRS基序突變在冠狀病毒進化中的作用

Beta 冠狀病毒B 亞群的重組區域全部集中在ORF1a基因和S基因的S1亞基對應的基因組區域（圖3），其中3個重組區（RC3至RC5）位于S1亞基的NTD結構域對應的基因組區域，另外兩個（RC6和RC7）位于S1亞基的RBD結構域對應的基因組區域。RC3至RC7重組區分別對應S蛋白的67-78，137-164，239-262，438-452，468-486位置的氨基酸。位于RBD結構域的RC6和RC7重組區對應的氨基酸對于病毒與宿主細胞受體結合至關重要。而中和抗體可以通過與病毒RBD結構域的關鍵氨基酸結合來阻斷病毒與受體結合，進而阻止病毒進入細胞。

2.4 RBD突變對中和抗體效力的影響

本研究采用此前提出的進化與分子功能聯合分析法，分析了GenBank數據庫全部冠狀病毒的基因組序列，結果發現：（1）冠狀病毒亞科的每一個屬（的所有病毒）只有一種經典TRS基序（高度保守），只有Beta冠狀病毒A亞群例外，它與同屬的其它幾個亞群的經典TRS基序不同（圖1）；（2）Beta 冠狀病毒B 亞群（特別是SARS-CoV 和SARS-CoV-2）的所有病毒基因組中的TRS-L和調控4個結構基因（S、E、M和N）的TRS-B中的經典TRS基序均沒有突變發生；（3）Beta冠狀病毒B亞群以外的各類群（即Alpha、Beta、Gamma和Delta冠狀病毒以及Beta冠狀病毒其它亞群）普遍存在至少一個調控結構基因的TRS-B中的經典TRS基序突變為非經典TRS基序。因此推斷：TRS基序突變導致Beta冠狀病毒B 亞群以外的各類群病毒的基因轉錄能力以及NSP15的調控能力降低，病毒減毒后最終失去了跨物種傳播和大爆發的能力，而僅與少量最適宿主長期共存；不帶TRS基序突變的Beta冠狀病毒B亞群是冠狀病毒中毒力最強的一個分支，將長期威脅人類健康。

根據對SARS-CoV-2資源庫中全部基因組突變信息的實時跟蹤與分析，我們發現多種突變株的基因組中已出現TRS-L中的TRS基序突變，這些病毒主要來自新加坡和墨西哥等國家。根據新加坡2021年3～5月采樣的基因組數據（表2），我們發現有一些毒株的TRS-L中的經典TRS 基序ACGAAC（基因組位置為MN908947：70-75）中的C突變為M（表示A或C）、S（表示G或C）或Y（表示T或C）；而G突變為R（表示A或G）。這些位點呈現的核苷酸殘基多態性（M、S、Y和R）不是測序錯誤導致的，極大可能是樣本（個人）體內存在了多個毒株共感染導致的。特別是，我們發現了分類為Delta 突變株B.1.617.2 型的一個新毒株（GISAID：EPI_ISL_2508633）的基因組的TRS-L中的TRS基序突變為ACAAAC（表2）。由于病毒群體的極大多樣性，基于當前獲得的少量樣本還無法準確評估TRS基序突變對于病毒流行的影響，因此還需進一步收集數據以得到準確的結果。

通過Outbreak.info網站對SARS-CoV-2 S蛋白突變位點的頻率進行統計。結合Beta冠狀病毒B亞群的5 個重組區（RC3 至RC5 位于NTD 結構域中，RC6 和RC7位于S1亞基的RBD結構域中）分析各種RBD突變對中和抗體的影響。

第一層素填土厚度約1.5m。γ平均值為18.5kN/m3，根據工程經驗取值C=2kPa，Φ=30°(下同)。

2.5 多種SARS-CoV-2突變株出現TRS基序突變

FPGA在整個硬件系統中起到協處理器的作用，主要是利用FPGA的數據并行流水線處理能力對紙病進行一次辨識，判斷出疑似紙病，提取出疑似紙病區域并通過以太網接口將該區域發送至計算機，而計算機則負責紙病的二次辨識，對紙病進行精確的識別和分類。由于FPGA承擔了98%以上的圖像數據處理任務，從而解決了系統的實時性問題[3]。本文主要說明利用FPGA實現基于分塊思想的多紙張缺陷一次提取算法。

在鑒定環曲病毒亞科的經典TRS基序（圖2）的過程中，我們首次發現了TRS-L中的TRS基序突變，突破了基于冠狀病毒科數據對經典TRS基序的認識，最典型的一個案例來自白鳊魚病毒基因組（RefSeq:NC_008516），新發現包括兩點：（1）其經典TRS 基序是AACACAGCACTACA（表1），該基序長度遠遠大于冠狀病毒亞科的經典TRS基序的常見長度（6～8 nt），推測此長度更接近冠狀病毒祖先的經典TRS基序的長度；（2）其TRS-L 中的TRS 基序突變為非經典TRS 基序AACACACAACAAG（表1），而冠狀病毒亞科的所有病毒的TRS-L中不存在TRS基序突變。

(1)分類職稱評審模式。以廣西職稱評審權下放到具體高校為契機，根據學院的辦學定位，結合各學科、崗位特點，建立分類、分層次的評審機制，用“教學和科研并重”的分類評價模式取代傳統的“重科研、輕教學”的評價，同時將教師的創新創業實踐及成果納入評價體系。如教師指導學生在國家級學科競賽獲得特等獎、一等獎的視同發表一篇中文核心，激發教師的創新創業活力。

3 討論

根據跳躍式轉錄的分子機制，TRS基序突變必然導致冠狀病毒基因的轉錄下降，這一點已得到實驗驗證。前期研究對冠狀病毒的其它基因組特征（最主要是S1/S2交界處的Furin蛋白酶切位點）導致的減毒也進行了系統性分析，并發現了冠狀病毒傳播和爆發的一些規律，特別是：（1）Beta冠狀病毒的祖先與其他類群分化后形成Beta冠狀病毒的各分支，這些分支總體上通過減毒或再次爆發得以廣泛傳播；（2）A亞群的直接祖先與Beta冠狀病毒的直接祖先分化最早，減毒程度最大，而且具有最高的多樣性；（3）B、D亞群的直接祖先隨后分開，伴隨進一步減毒；（4）C亞群的直接祖先分化最晚，仍然保留了第二Furin蛋白酶切位點，因此減毒程度很小。對比本研究與以上前期研究結果，我們發現：TRS基序突變導致的減毒與Furin蛋白酶切位點導致的減毒在冠狀病毒進化中的變化趨勢整體一致，特別是：Beta冠狀病毒B亞群所有病毒均未發生TRS基序突變；C亞群（例如MERS-CoV，GenkBank：JX869059）僅有N基因的TRS-B中的TRS基序突變為ACGAATC；E亞群（例如GenkBank：NC_025217）僅有S基因的TRS-B中的TRS基序突變為ACGGAAC。因此，我們推斷：Beta冠狀病毒B、C和E亞群仍然處于活躍期，將長期威脅人類健康，直到這些病毒通過TRS基序突變繼續減毒，才能最終失去跨物種傳播和大爆發的能力。

森林生態系統碳儲量估測一般分微氣象學法、樣地清查法、箱式法、數學模型法、遙感估測法[4-7]，此次采用樣地清查法中的生物量轉換因子法估算純林、混交林、散生木和四旁樹的碳儲量，采用平均生物量法估算喬木經濟林、灌木經濟林、疏林地、灌木林地(不含灌木經濟林)碳儲量。

根據重組區RC6和RC7內關鍵氨基酸的鑒定結果，有研究對2021 年初流行的Alpha（B.1.1.7）、Beta（B.1.351）和Delta（B.1.617）突變株對中和抗體的影響做了簡單評估。Alpha 突變株的3 個主要突變（69-70Del、N501Y和P681H）均不涉及RC6和RC7重組區；Beta突變株的3個主要突變（K417N、E484K和N501Y）中，有一個E484K涉及RC7重組區，預測會對中和抗體的作用效果產生輕微影響；作為SARS-CoV-2最著名的突變D614G，不涉及RC6和RC7重組區。然而，Delta突變株的兩個突變位點（L452R 和E484K）分別位于RC6和RC7重組區內，預測會對作用效果產生重大影響；來自南美的Lambda突變株（C37）同時具有8個主要突變，分別位于RC3（G75V和T76I）、RC4（R246N、247-253Del）、RC6（L452Q）和其它區域（F490S、D614G 和T859N），因此，也對中和抗體的作用效果產生較大影響。特別是，247-253Del幾乎導致了RC4的缺失。從最早的突變E484K 開始，到Delta 突變株的雙重突變（L452R和E484K），SARS-CoV-2已經產生了逃逸，即在中和抗體的選擇壓力下，一部分突變株生存下來，并獲得進一步傳播的機會，以上分析已得到后續的實驗驗證。Delta突變株出現后，Delta突變株與此前出現的突變株有顯著不同，如果不高度重視，可能引起大規模傳播。如果Delta突變株產生TRS基序突變，可能會導致超級減毒株的出現，可引起無癥或輕癥感染者增多，潛伏時間長，以及漏檢率上升等問題，對SARSCoV-2的防控將提出新的挑戰。根據前期研究結果，NTD結構域與RBD結構域發生過同樣多的重組事件，說明有同樣大的正向選擇壓力，因此有可能存在第二受體與NTD相互作用。

冠狀病毒強大的重組能力是導致其反復爆發的最主要因素，冠狀病毒的進化歷史顯示了其爆發-減毒-再次爆發的規律性。減毒的來源主要包括RBD區域突變、S1/S2交界處的Furin蛋白酶切位點突變和TRS基序突變等。值得注意的是，TRS基序突變與其導致的減毒不可逆，而其它因素導致的減毒是可逆的。SARSCoV-2爆發的一個重要原因就是因獲得Furin蛋白酶切位點而導致其傳播力增強。而SARS-CoV-2爆發不久，就有報道Furin 蛋白酶切位點丟失的減毒株（GISAID:EPI_ISL_417443）；最近出現的Omicron突變株則可能產生雙重Furin蛋白酶切位點，因此獲得更大傳播力。Omicron突變株，經過多次重組形成，情況非常復雜，但基本上屬于RBD 區域突變導致的減毒株。目前尚未發現大量Omicron突變株的基因組中存在TRS基序突變，因此，當前的Omicron突變株并不是最終的超級減毒株。根據我們的模型，包括Omicron突變株在內的各種突變株都將產生TRS基序突變，只有帶TRS基序突變的超級減毒株，才能最終失去跨物種傳播和大爆發的能力。超級減毒株通過回復突變再引起大爆發的可能性幾乎不存在，然而，如果多種超級減毒株長期共存，會形成一個龐大的基因庫，可與其他非減毒株進行重組，因此，其威脅更大。

本研究分析了墨西哥2021年3～4月采樣的大量數據，發現大量（被GISAID）分類為B.1.1.519型的毒株也出現了TRS基序突變。來自新加坡和墨西哥的不同毒株在相近的時間段都出現TRS基序突變，值得進一步深入研究。當前的病毒核酸檢測一般無法獲得基因組數據；高通量測序可以獲得基因組數據，但是對于多個病毒株的共感染樣品，含量高的毒株會掩蓋含量低的減毒株，最后得到的一致性序列會丟失很多重要的信息。因此，希望疾控部門監測上傳的基因組數據（特別是高通量測序數據）中的TRS基序突變，以便及早應對可能出現的超級減毒株。帶TRS基序突變的B.1.1.7突變株已經向日本（GISAID：EPI_ISL_2771613 等）和德國（GISAID：EPI_ISL_2759898等）擴散；帶TRS基序突變的B.1.617.2 突變株已經向印度尼西亞（GISAID：EPI_ISL_2931745 等）和英國（GISAID：EPI_ISL_2852198等）擴散。這些數據再次驗證了我們的部分預測。