微波輻射預處理菌源對生物暗發酵制氫的影響

張靖楠，昌行行，張嘉祺，何培新，張志平，宋麗麗，楊旭，魏濤

鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001

0 引言

隨著全球工業化的發展，環境污染和能源危機已成為制約社會發展的重要因素。氫能作為一種高效、清潔的可再生能源，在社會生產實踐中的應用范圍不斷擴展，是未來重要的新能源物質[1]。暗發酵制氫是指微生物利用氫酶的催化作用降解有機物產生H2，同時生成揮發性脂肪酸(VFAs)、醇類等代謝產物[2]。與其他制氫方法相比，暗發酵制氫具有產H2速率高、工藝簡單、底物利用范圍廣等優勢[3]。目前，暗發酵制氫通常采用堆肥、污泥[4-5]、牧畜糞便[6-7]等作為發酵菌源。這些天然混合菌源中不僅含有嚴格厭氧的梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、兼性厭氧的埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)[8]等產氫菌，同時也存在產甲烷菌[9]、產乙酸菌[10]等耗氫菌。耗氫微生物的存在勢必會對暗發酵制氫產生負面影響。為了獲得高效的產氫菌，同時抑制或殺滅耗氫菌，在暗發酵制氫前通常需要對菌源進行預處理。目前常用的菌源預處理方式主要包括酸、堿[11-12]、化學抑制劑[13]、水熱[14]、超聲波[15-16]等，這些預處理方法普遍存在操作復雜、處理時間長、能耗高等缺點。因此，有必要尋求新的安全高效、操作簡便的菌源預處理方法。

微波是指波長為1 mm～1 m，頻率為300 MHz～3000 GHz的電磁波[17]。微波輻射作為一種節能高效的熱能技術，具有加熱效率高、過程易控、環境友好等特點[18]，被廣泛用于生物質酶解產糖、食品加工、環境污染治理等諸多領域[19-20]。馬歡等[21]采用微波輻射技術對水稻秸稈進行預處理，發現微波輻射可以破壞水稻秸稈表面特殊的“角質-雙硅層”結構和木質素-半纖維素復合體，提高纖維素酶的酶解效果。微波輻射還可以通過熱效應和非熱效應破壞微生物菌體[22]，抑制和殺滅不耐受高溫的微生物菌體。目前，微波輻射及微波輔助酸或堿預處理工農業有機廢物暗發酵制氫的研究多側重于預處理工藝優化或對有機廢物結構變化的影響[23-26]，鮮見微波輻射預處理引起菌源微生物群落結構變化進而影響暗發酵制氫的研究。

本文以牛糞堆肥為天然菌源、葡萄糖為發酵底物，擬考查微波輻射預處理對生物暗發酵制氫性能的影響，采用Illumina NovaSeq高通量測序技術對微波輻射預處理前后菌源的菌群結構進行解析，以期揭示微波輻射預處理引起的微生物群落結構變化影響暗發酵制氫的機制，為構建穩定、高效的暗發酵制氫體系提供一定的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛糞堆肥(含水率40%左右)，取自鄭州市新鄭奶牛場；葡萄糖及其他常用化學試劑，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產。

1.2 培養基

種子發酵培養基(600 mL)：葡萄糖6.0 g，L-半胱氨酸0.3 g，蛋白胨2.4 g，NaCl 1.8 g，FeSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.6 g，K2HPO40.6 g，MgCl20.06 g，pH值為7.0。

發酵產氫培養基(50 mL)：葡萄糖0.5 g，L-半胱氨酸0.025 g，KH2PO40.05 g，NH4HCO30.05 g，去離子水45 mL，種子液5 mL，營養液0.3 mL，調節pH值為 6.5。

營養液(1 L)：FeCl20.002 78 g，NaCl 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，Na2MO4·2H2O 0.01 g，MnSO4·7H2O 0.015 g。

1.3 主要儀器與設備

M1-L213B型微波爐，美的集團股份有限公司產；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司產；Aglient-7890B型氣相色譜儀、Aglient-7820A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產；D2012plus型離心機，大龍興創實驗儀器股份公司產；SHC-A型H2發生器、QLB-A型純凈空氣泵，北京創杰新世紀科技發展有限公司產。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌源預處理在前期研究的基礎上，將牛糞堆肥與去離子水按照料液比1∶2.2(g/mL)混合，微波輻射5 min后，用篩網過濾收集菌液。未微波輻射處理的菌源作為對照組。

1.4.2 種子預培養將1.4.1中所得菌液放入裝有種子發酵培養基的血清瓶中，充N2營造厭氧環境，封蓋后放入搖床，設置搖床轉速160 r/min，溫度(35±1) ℃進行種子預培養。

1.4.3 暗發酵產氣實驗采用10%接種量將培養至對數期的種子液移取至含有葡萄糖的發酵產氫培養基中，調節發酵體系初始pH值為6.5，充入高純N2除去培養基中的O2，封蓋后放入搖床，設置搖床轉速160 r/min，溫度(35±1) ℃進行發酵產氣實驗，定期取樣分析氣體成分和液相代謝產物。

1.5 分析方法

1.5.1 氣相產物分析采用定時排飽和食鹽水法測量發酵瓶內的氣體體積。采用氣相色譜儀(Aglient-7890B)測定氣相產物(H2，CH4，CO2)含量，檢測條件如下：色譜儀安裝熱導池檢測器(TCD)，色譜柱為6英尺Porapak Q不銹鋼填充柱，高純N2為載氣(30 mL/min)，TCD檢測溫度為150 ℃，柱溫為50 ℃，手動進樣，進樣量為400 μL，進樣口溫度為150 ℃[27]。

1.5.2 液相代謝產物分析采用氣相色譜儀(Aglient-7820A) 測定液相代謝產物，檢測條件如下：色譜儀安裝氫火焰檢測器(FID)，FID檢測溫度為280 ℃，色譜柱為HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純N2為載氣(30 mL/min)，升溫過程為35 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至100 ℃并保持2 min；SHC-A型H2發生器的H2流量為40 mL/min；QLB-A型純凈空氣泵的空氣流量為400 mL/min；自動進樣，進樣量為0.5 μL，進樣口溫度為220 ℃；分流比為10∶1。進樣前，將發酵液抽濾后加入濃度為6 mol/L的HCl進行酸化，再用高速離心機于8000 r/min條件下離心10 min，取1.5 mL上清液，用0.45 μm濾膜過濾后進行測定[27]。

1.5.3 菌群結構分析采用Illumina NovaSeq高通量測序技術對細菌16S rDNA V3-V4 區和古生菌16S rDNA進行測序。細菌V3-V4區引物為：357F(5′-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。古生菌引物為：Arch519F(5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′)，Arch915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)。對測定后的原始序列進行質控、拼接和序列優化，優化后的序列用Usearch軟件對數據進行去嵌合體和聚類分析，以97%相似度為標準將序列聚類成為分類單元，將操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)代表序列與Silva數據庫比對并進行物種注釋，利用mothur(Version 1.33.3)進行Alpha多樣性指數分析(包括Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數等物種多樣性分析)；選取不同的分類水平進行群落組成的統計分析；利用R語言進行韋恩(Venn)圖、群落結構柱形圖等統計學和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 微波輻射預處理對暗發酵產氣的影響分析

暗發酵制氫過程中累積產氣量變化曲線如圖1所示。由圖1可以看出，微波輻射預處理樣品在24 h左右累積產H2量達到最大值，為109.9 mL/g，對照組在28 h累積產H2量達到最大值，為85.9 mL/g，微波輻射預處理組累積產H2量較對照組提高了27.9%；無論對照組還是微波輻射預處理組，均在第8 h檢測到CO2的產生，但在暗發酵過程中，微波輻射預處理組的累計產CO2量始終大于對照組。在整個暗發酵過程中，無論是微波輻射預處理組還是對照組，均未檢測到CH4的產生。這可能是因為產甲烷菌的最佳生長pH值為6.5～8.2[28]，而本實驗發酵初始pH值為6.5，酸化和產氫產乙酸階段生成的揮發性有機酸會導致發酵系統pH值大幅度下降[29]，當pH值<6或pH值>8時，會對產甲烷菌的活性產生抑制，進而影響CH4的生成[30]。

圖1 暗發酵制氫過程中累積產氣量變化曲線Fig.1 Change curve of cumulative gas production during dark fermentative hydrogen production

2.2 微波輻射預處理對液相代謝產物的影響分析

揮發性有機酸醇是暗發酵制氫過程中的主要副產物。液相代謝產物組成及其質量濃度如圖2所示。由圖2可以看出，在發酵初期(0～4 h)，丙酸和乙酸均為微波輻射預處理組和對照組的主要液相代謝產物。在發酵中期(4～24 h)，液相代謝產物發生明顯變化，對照組丙酸含量大幅增加，乙酸含量相對減少；微波輻射預處理組丙酸含量明顯減小，丁酸含量明顯增加。發酵24 h時，微波輻射預處理組的丁酸累積含量達到最大值0.8 g/L，此時累積產H2量也達到最大值。暗發酵結束時，微波輻射預處理組的丁酸含量較對照組提高了24.1%。這與宋梓梅等[31]的研究結果一致，代謝產物中丁酸含量的增長有助于提高厭氧發酵的H2產量。

圖2 液相代謝產物組成及其質量濃度Fig.2 Composition and mass concentration of liquid phase metabolites

2.3 微波輻射預處理對菌源菌群結構的影響分析

2.3.1Alpha多樣性指數分析菌源菌群Alpha多樣性指數比較見表1。由表1可知，各組樣品的Coverage指數均>0.99，表明本次測序對樣品中的細菌和古生菌的覆蓋率較高，可滿足各組樣品中細菌和古生菌Alpha多樣性分析的需要。微波輻射預處理組中，細菌和古生菌的Chao1指數都低于對照組，表明經微波輻射預處理后，菌源物種種類減少，豐度降低；古生菌的Chao1指數遠低于細菌，也表明菌源中古生菌的豐度遠低于細菌。另外，與對照組相比，微波輻射預處理組中細菌和古生菌的Shannon指數較小，而Simpson指數較大，表明經微波輻射預處理后，細菌和古生菌的多樣性降低。

表1 菌源菌群Alpha多樣性指數比較Table 1 Comparison of Alpha diversity index of bacteria

2.3.2Veen圖分析Venn圖可用于統計多個樣本所共有和獨有的OTU數目，能直觀反映樣本的物種數目組成相似性及重疊情況[32]。細菌和古生菌基于OTU水平的群落Veen圖如圖3所示。由圖3可以看出，細菌群落共有的OTU數目為916個，分別占對照組和微波輻射預處理組樣本OTU總數的92.9%和93.1%；古生菌群落共有的OTU數目為52個，分別占對照組和微波輻射預處理組樣本OTU總數的70.3%和81.3%。這表明，經微波輻射預處理后，菌源樣本的細菌群落相對較穩定，豐度有一定程度降低，而古生菌群落豐度下降較大。

圖3 細菌和古生菌基于OTU水平的群落Veen圖Fig.3 Community Venn diagram of bacteria and archaea based on OTU level

2.3.3 群落結構分析1)細菌門和屬的變化分析。16S rRNA基因高通量測序及分析表明，細菌群落共發現29個門，176個屬。細菌群落在門水平上的相對豐度如圖4a)所示。由圖4a)可以看出，對照組中，相對豐度相對較高的細菌依次為變形菌門(Proteobacteria，44.9%)、綠彎菌門(Chloroflexi，14.43%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，11.5%)、放線菌門(Actinobacteria，6.51%)和厚壁菌門(Firmicutes，2.89%)；微波輻射預處理組中，相對豐度相對較高的細菌依次為變形菌門(46.5%)、綠彎菌門(14.42%)、放線菌門(7.7%)、擬桿菌門(6.11%)和厚壁菌門(4.7%)。這表明，經微波輻射預處理后，菌源中的變形菌門、放線菌門和厚壁菌門的相對豐度均升高，而擬桿菌門的相對豐度降低。

細菌群落在屬水平上的相對豐度如圖4b)所示。由圖4b)可以看出，檢測到的主要細菌屬為特呂珀菌屬(Truepera)、Bauldia、膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus)、假洪吉氏菌屬(Pseudohongiella)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。微波輻射預處理后，能有效降解有機物的特呂珀菌屬[33]和膨脹芽孢桿菌屬[34-35]細菌的相對豐度均升高。值得注意的是，與對照組相比，經微波輻射預處理后，菌源中芽孢桿菌屬的相對豐度增加，表明微波輻射預處理能夠有效抑制或殺滅不產芽孢的細菌。芽孢桿菌是主要的厭氧發酵產氫菌[8]，其相對豐度的增加有利于發酵系統產H2量的增加。

圖4 細菌群落在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at level of phylum and genus

2)古生菌門和屬的變化分析。古生菌群落在門水平上的相對豐度如圖5a)所示。由圖5a)可以看出，對照組中，廣古生菌門(Euryarchaeota)的相對豐度較高，為51.68%；奇古生菌門(Thaumarchaeota) 相對豐度為48.32%。廣古生菌門是耗氫產甲烷菌的主要來源[36]。經微波輻射預處理后，廣古生菌門相對豐度減少至31.65%，而奇古生菌門相對豐度增長至68.35%，表明經微波輻射預處理后，菌源中的產甲烷菌數量減少。

古生菌群落在屬水平上的相對豐度如圖5b)所示。由圖5b)可以看出，未確定分類地位的古生菌相對豐度較高(91%左右)。屬水平上，主要的優勢古生菌為甲烷短桿菌屬(Methanobrevibater)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、第七產甲烷古菌屬(Methanomassiliicoccus)、甲烷球形菌屬(Methano-sphaera)和甲烷囊菌屬(Methanoculleus)，此外還有少量的產甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)古生菌。產甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬都屬于氫營養型產甲烷菌，均能夠以H2作為電子供體，通過電子傳遞，還原CO2生成CH4[37-38]；甲烷球形菌屬同樣可以利用H2作為電子供體，還原甲醇生成CH4，但必須以乙酸作為生長因子[39]；鬃毛甲烷菌屬以H2、甲酸鹽、二元醇和CO作為電子供體，還原CO2生成CH4[40]；第七產甲烷古菌屬屬于甲基營養型和氫營養型的混合型[41]；甲烷八疊球菌屬在厭氧消化過程中以乙酸作為代謝底物[42]，同時還能以甲醇、甲胺、H2/CO2為代謝基質[43]。經微波輻射預處理后，甲烷八疊球菌屬、第七產甲烷古菌屬、甲烷球形菌屬的相對豐度均減小，甲烷短桿菌屬的相對豐度略有升高。這可能是因為產甲烷桿菌屬和鬃毛甲烷菌屬的相對豐度減小，造成甲烷短桿菌屬的相對豐度略有升高。上述分析表明，微波輻射預處理后，產甲烷菌相對豐度的減小降低了暗發酵制氫過程中的耗氫作用，使系統的產H2性能得以提高。

圖5 古生菌群落在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance of archaea community at level of phylum and genus

3 結論

本文研究了微波輻射預處理牛糞堆肥菌源微生物群落結構變化對暗發酵制氫性能的影響。結果表明，經微波輻射預處理后，菌源暗發酵的最大累積產H2量達109.9 mL/g，比對照組提高了27.9%；高通量測序顯示，微波輻射預處理導致菌源微生物數量減少，而主要的厭氧發酵產氫菌芽孢桿菌屬的相對豐度比對照組有所升高，產甲烷桿菌屬等產甲烷耗氫菌的相對豐度降低。微波輻射能夠損傷微生物基因組DNA，抑制或殺滅敏感的耗氫菌。主要的產氫微生物芽孢桿菌則具有極強的耐輻射和耐熱能力，短時間微波輻射處理不會對其造成損傷，因而微波輻射預處理后系統的產H2能力得以提高?？梢?，采用微波輻射預處理產氫菌源，能夠抑制產甲烷耗氫菌的活性，同時保留產氫微生物芽孢桿菌的活性，是有效提高暗發酵制氫產H2量的方法之一。后續實驗將進一步探究微生物種群之間的互作關系，解析微生物代謝途徑與產H2量之間的關聯性，以期為暗發酵制氫提供更好的技術調控策略。