H2O2對人晶狀體上皮細胞AQP1和AQP5表達影響及其機制

李璐　彭旭東　林靜　趙桂秋

[摘要]目的探究氧化應激對晶狀體上皮細胞（HLECs）水通道蛋白（AQPs）表達的影響及其機制。方法取健康人群和白內障病人的晶狀體前囊膜，應用實時熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組織化學染色方法檢測兩組AQP1和AQP5表達與分布情況。應用RT-PCR方法檢測不同濃度的H₂O₂作用HLECs不同時間后AQP1和AQP5 mRNA表達情況;用400 μmol/L的H₂O₂刺激HLECs不同時間，Western blot方法檢測AQP1和AQP5蛋白表達，RT-PCR和Western blot分別檢測絲裂酶原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制劑聯合H₂O₂（400 μmol/L）共同作用于HLECs后AQP1和AQP5的mRNA與蛋白的表達情況。結果白內障組晶狀體前囊膜中AQP1和AQP5的mRNA表達與分布明顯低于健康組（t=10.71、5.46，P<0.05）。H₂O₂刺激HLECs引起的AQP1和AQP5 mRNA表達下調具有濃度和時間依賴性（F_濃度=80.38、436.20，F_時間=46.95、175.00，F_交互=7.99、17.52，P<0.01）。其中以400 μmol/L的H₂O₂作用最為明顯，分別在作用4、24 h時AQP1和AQP5的mRNA與蛋白表達降至最低水平（t=3.32～5.31，P<0.05）。p38和細胞外信號調節激酶（ERK）抑制劑可以抑制H₂O₂誘導的AQP1的mRNA和蛋白表達下調（t=4.37～7.28，P<0.05），JNK、p38和ERK的抑制劑對AQP5的表達量無明顯作用（P>0.05）。結論氧化應激使HLECs AQP1和AQP5表達下降;在氧化應激條件下，MAPK（p38和ERK）途徑參與AQP1表達調控，但MAPK途徑不參與AQP5的表達調控。

[關鍵詞]晶狀體;上皮細胞;水孔蛋白質類;絲裂原激活蛋白激酶類;過氧化氫

[中圖分類號]R34;R776.1[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0173-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.049[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220314.0851.001.html;2022-03-1512：03：24

EFFECTS OF H₂O₂ON EXPRESSION OF AQP1 AND AQP5 IN HUMAN LENS EPITHELIAL CELLS AND THE UNDERLYING MECHANISMS? LI Lu， PENG Xudong， LIN Jing， ZHAO Guiqiu? （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effects of oxidative stress on the expression of aquaporins （AQPs） in human lens epithelial cells （HLECs） and the underlying mechanisms. MethodsThe anterior lens capsules from healthy people and patients with cataract were collected. RT-PCR and immunohistochemistry were used to determine the expression and distribution of AQP1 and AQP5 in both groups. After stimulating HLECs by different concentrations of H₂O₂for different lengths of time， the mRNA expression of AQP1 and AQP5 was measured by RT-PCR. With H₂O₂at 400 μmol/L stimulating HLECs for different lengths of time， the protein expression of AQP1 and AQP5 was measured by Western blot. After using mitogen-activated protein kinase （MAPK） inhibitors and H₂O₂（400 μmol/L） combined to stimulate HLECs， the mRNA and protein expression of AQP1 and AQP5 was determined by RT-PCR and Western blot， respectively. ResultsThe cataract group showed significantly lower mRNA expression and distribution of AQP1 and AQP5 in the anterior lens capsule compared with the healthy group （t=10.71，5.46;P<0.05）. H₂O₂down-regulated the mRNA expression of AQP1 and AQP5 in a concentration- and time-dependent manner （F_{concentration}=80.38，436.20;F_time=46.95，175.00;F_interaction=7.99，17.52;P<0.01）. H₂O₂showed the greatest effects at 400 μmol/L， with the lowest mRNA and protein expression of AQP1 and AQP5 at 4 h and 24 h， respectively （t=3.32-5.31，P<0.05）. Inhibitors of p38 and extracellular signal-regulated kinase （ERK） could significantly inhibit H₂O₂-induced down-regulation of AQP1 mRNA and protein （t=4.37-7.28，P<0.05）. Inhibitors of c-Jun N-terminal kinase， p38， and ERK had no significant effects on the expression of AQP5 （P>0.05）. ConclusionOxidative stress reduces the expression of AQP1 and AQP5 in HLECs. Under oxidative stress， the MAPK pathways （p38 and ERK） are involved in the regulation of AQP1 expression， but not in the regulation of AQP5 expression.

[KEY WORDS]lens， crystalline;? epithelial cells;? aquaporins; mitogen-activated protein kinases; hydrogen peroxide

目前，由于人口老齡化程度不斷加劇，在成年白內障病人中年齡相關性白內障（ARC）明顯多于其他類型，氧化損傷在該類型白內障的發生發展過程中具有重要作用[1]。隨著年齡的增長，晶狀體內抗氧化物質逐漸降低，從而導致氧化物積聚在晶狀體中[2]，氧化物的積累使核DNA和蛋白質遭到破壞，從而導致晶狀體混濁[3]。氧化應激可以使絲裂酶原激活的蛋白激酶（MAPK）通路中的c-Jun N末端激酶（JNK）、p38、細胞外信號調節激酶（ERK）蛋白磷酸化，參與組織氧化損傷的病理過程[4]。水通道蛋白（AQPs）的作用是通過調節溶質主動轉運，使晶狀體內外的滲透壓達到動態平衡，以維持晶狀體的穩態與透明性[5]。 本研究探討H₂O₂的氧化作用對人晶狀體上皮細胞（HLECs）AQP1和AQP5表達的影響，以及MAPK（JNK、p38、ERK）信號通路是否參與調控該條件下AQP1和AQP5表達的變化?，F將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

人晶狀體囊膜取自青島大學附屬醫院倫理委員會批準的健康供體和白內障病人。白內障組晶狀體前囊膜由白內障超聲乳化過程中環形撕取前囊膜獲得，正常組晶狀體前囊膜從我院低溫醫學科提供的供體眼球獲得。將晶狀體前囊膜放入-80 ℃冰箱保存。HLECs（廣州Jennio Biotech公司）;胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）;青霉素G、DMEM培養液（美國Gibco公司）;硫酸鏈霉素、蛋白裂解緩沖液（RIPA∶PMSF=1 000∶1）、EDTA液（北京So-labio公司）;JNK抑制劑（SP600125）、p38抑制劑（SB203580）、ERK抑制劑（U0126）（美國Selleckchem公司）;RNAiso Plus（購自大連TaKaRa公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（購自武漢Elabscience公司）;Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒（購自南京Vazyme公司）;RM 2025切片機（德國徠卡公司）;DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）;光學顯微鏡（日本Olympus IXSO公司）。

1.2實驗方法

1.2.1HLECs培養將HLECs接種于含有體積分數0.10青霉素G（濃度0.1 μg/L）和硫酸鏈霉素（0.1 μg/L）的DMEM培養液中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO₂、90%濕度環境中培養。 待細胞生長達80%融合時，加入2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA液2 mL，調整HLECs密度為1×10¹¹/L的細胞懸浮液，接種到12孔或6孔組織培養板上，待細胞達到80%融合且生長均勻時換成不含血清的DMEM培養液。

1.2.2HLECs分組及處理將細胞隨機分為空白對照組、H₂O₂刺激組和MAPK抑制劑組?？瞻讓φ战M不做任何處理。H₂O₂刺激組分別加入100、200、400和800 μmol/L的H₂O₂，分別培養1、2、4和6 h收集細胞用于RT-PCR檢測;H₂O₂刺激組每孔加入400 μmol/L的H₂O₂，分別培養4、8、16、24 h收集細胞用于Western blot檢測。抑制劑組分別加入JNK抑制劑（2.5×10^-5mol/L）、p38抑制劑（1×10^-5mol/L）、ERK抑制劑（2×10^-5mol/L）預處理1 h后再加400 μmol/L的H₂O₂，刺激4 h后收集細胞用于RT-PCR檢測，刺激24 h后收集細胞用于Western blot檢測。

1.2.3免疫組織化學染色檢測晶狀體前囊膜上皮細胞AQP1和AQP5分布情況晶狀體前囊膜經常規固定、脫水、透明、浸潤和包埋處理以后，使用RM 2025切片機行4 μm厚切片，然后脫蠟和水合，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。應用檸檬酸緩沖液（pH值6.0）高壓修復抗原2 min后再用PBS洗片3次。37 ℃下與兔抗人AQP1和小鼠抗人AQP5一抗（1∶200稀釋，美國Abcam公司）反應2 h，洗片后再與聚過氧化物酶羊抗兔/小鼠IgG二抗（上海Beyotime公司）反應30 min。用DAB試劑盒處理切片，光學顯微鏡下觀察，當細胞膜出現棕色顆粒立即用蒸餾水沖洗，然后用蘇木精復染1 min，脫水，中性香脂封片后光鏡下觀察并拍片。用Image-proplus軟件分析AQP1和AQP5分布。

1.2.4實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測AQP1和AQP5的mRNA表達用RNAiso Plus提取晶狀體前囊膜上皮細胞和各組HLECs總RNA，按Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書進行逆轉錄。以β-actin為內參照，應用RT-PCR儀獲得循環數，計算AQP1和AQP5的mRNA表達量。實驗重復3次。PCR引物及其序列由大連TaKaRa公司設計與合成。見表1。

1.2.5Western blot檢測AQP1和AQP5蛋白表達用蛋白裂解緩沖液收集各組HLECs細胞蛋白[6]，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度

2期李璐，等. H₂O₂對人晶狀體上皮細胞AQP1和AQP5表達影響及其機制175

并計算上樣量，經蛋白煮沸變性、電泳、轉膜、PBST漂洗后，用封閉液進行2 h封閉，之后加入一抗稀釋液β-actin（1∶2 000）、AQP1（1∶1 000）、AQP5（1∶1 000）（美國Abcam公司）4 ℃孵育16 h。PBST搖洗3次后加入二抗（山羊抗兔二抗1∶5 000、山羊抗鼠二抗1∶500）（美國Millipore公司）室溫孵育2 h。再次用PBST搖洗3次后使用UVP凝膠成像系統顯影并拍照，用Image J軟件定量分析條帶的灰度值，以其表示蛋白的表達量。

1.3統計學處理

使用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。計量資料數據以x±s表示，兩組數據比較使用LSD-t檢驗;多組數據比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）或析因設計的方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1正常組和白內障組晶狀體前囊膜AQP1和AQP5 mRNA表達和分布比較

正常組前囊膜上皮細胞中AQP1和AQP5的mRNA表達明顯高于白內障組，差異有顯著性（t=10.71、5.46，P<0.05）。免疫組織化學染色顯示，與正常組相比，白內障組晶狀體前囊膜中的棕色顆粒顯著減少，而且細胞大小不一、形狀排列不規則。見圖1和表2。

2.2不同H₂O₂處理組間HLECs AQP1和AQP5 mRNA與蛋白表達比較

H₂O₂刺激HLECs所引起的AQP1和AQP5 mRNA表達下調具有濃度和時間依賴性（F_濃度=80.38、436.20，F_時間=46.95、175.00，F_交互=7.99、17.52，P<0.01）。其中以400 μmol/L的H₂O₂作用最為明顯，在4 h時AQP1和AQP5的mRNA表達降至最低水平（t=3.32～5.31，P<0.05）。見表3、4。在濃度為400 μmol/L的H₂O₂作用下，AQP1和AQP5蛋白表達下降呈時間依賴性，H₂O₂不同作用時間AQP1和AQP5蛋白表達差異有統計學意義（F=11.63、8.04，P<0.05），在24 h降至最低水平。見表5。

2.3MAPK抑制劑對AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達的影響

各組間AQP1、AQP5 mRNA和蛋白表達差異有統計學意義（F=9.81～45.34，P<0.05），與單純H₂O₂處理組相比，ERK和p38抑制劑預處理顯著抑制了H₂O₂誘導的AQP1 mRNA和蛋白表達下調（t=4.37～7.28，P<0.05），而JNK抑制劑預處理組AQP1 mRNA與蛋白的表達與單純H₂O₂處理組相比差異均無統計學意義（P>0.05）。與單純H₂O₂處理組相比，ERK、p38和JNK抑制劑預處理組AQP5的mRNA和蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表6。

3討論

白內障是一種由于晶狀體混濁而影響視覺功能的疾病，主要是由與年齡有關的晶狀體變性引起的[7-8]。目前，治療白內障最有效的方式是通過手術摘除混濁晶狀體并植入人工晶體（IOL）[9]。但是，手術相關的并發癥依然給病人視力的恢復帶來極大的挑戰[10]。因此，有必要對白內障的發病機制進行進一步的研究，以期獲得并發癥較少的治療方式。

目前學術界一致認為，白內障的形成主要是由氧化損傷所導致[11]。構成晶狀體蛋白的一些氨基酸對氧化損傷特別敏感，如半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸等，它們的結構變化皆可引起蛋白質的變性，造成晶狀體混濁[12]。導致體內氧化損傷的主要因素是活性氧（ROS），而H₂O₂是細胞中含量最豐富、最穩定的ROS[13]。

AQPs介導水在細胞膜上的被動運輸，并參與維持細胞穩態[14]。既往研究結果結果表明，在哺乳動物HLECs中表達的AQPs包括AQP0、AQP1和AQP5[15]，與白內障密切相關[16]。有研究表明，敲除小鼠HLECs AQP1和AQP5雖然晶狀體形態和透明性沒有改變，但其水滲透性比正常小鼠晶狀體明顯降低，并且在高糖溶液中更容易渾濁[17-18]。為研究白內障病人晶狀體前囊膜上皮細胞中AQP1和AQP5的表達變化，本文收集了白內障病人和健康供體的晶狀體前囊膜，應用RT-PCR和免疫組化方法進行研究，結果顯示白內障組AQP1和AQP5的mRNA表達明顯低于正常組，白內障組晶狀體前囊膜上皮細胞的數量較正常組明顯減少且排列不規則，AQP1和AQP5的分布明顯低于正常組。說明AQP1和AQP5的表達下降與白內障的發生發展關系密切。

既往有研究證實，在高氧肺損傷新生小鼠的肺組織中AQP1和AQP5蛋白表達較對照組明顯降低[19]。為了探討氧化損傷對HLECs AQPs表達的影響，本研究體外培養了HLECs，并用H₂O₂處理模擬了氧化損傷，結果顯示，H₂O₂的濃度越高、作用時間越長，AQP1和AQP5的mRNA和蛋白表達水平下降越明顯;H₂O₂濃度為400 μmol/L時作用最為明顯，分別在作用4 h和 24 h 時AQP1、AQP5的mRNA和蛋白表達水平降至最低。

目前，關于氧化損傷引起HLECs的AQP1和AQP5表達下調的具體機制尚不清楚。相關研究發現，MAPK通路參與視網膜氧化損傷過程中AQP1表達的調控[20]。但是，對于AQP5在晶狀體氧化損傷過程中表達變化及其具體機制目前尚未見報道。MAPK是一組能夠被多種細胞外刺激物激活、參與調控細胞炎癥和死亡過程的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。最近的研究結果表明，氧化應激也可以激活MAPK[21]。晶狀體中存在的MAPK途徑包括Raf-Mek-ERK、 SAPK-JNK和p38 MAPK[22]。但是，氧化應激下MAPK如何調節AQP1和AQP5的表達目前仍不清楚[23]。本文研究結果顯示，HLECs經ERK和p38抑制劑處理后，H₂O₂介導的AQP1表達下調受到抑制，而JNK抑制劑對AQP1表達無明顯影響;ERK、p38和JNK的抑制劑均對AQP5表達無顯著作用。這表明在HLECs的氧化損傷過程中，MAPK途徑（ERK和p38）在調節AQP1表達中起重要作用，但MAPK途徑不參與AQP5的表達調控。

綜上所述，白內障病人晶狀體前囊膜上皮細胞AQP1和AQP5表達較正常組減少，H₂O₂刺激可導致HLECs中AQP1和AQP5表達下調。MAPK途徑中的ERK和p38途徑均介導H₂O₂刺激引起的HLECs中AQP1表達下調;MAPK途徑（ERK、p38和JNK）不參與H₂O₂介導的AQP5表達變化的調控。

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（本文編輯黃建鄉）