高效液相色譜法測定替格瑞洛原料藥中異構體的含量

蔡麗朋，周 琪

（江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000）

替格瑞洛是英國阿斯利康公司研發的一種選擇性小分子抗凝血藥物，用于治療急性冠狀動脈綜合征（ACS）[1]。替格瑞洛含有6 個手性中心，理論上有2（664）個異構體。對于本公司研制的替格瑞洛原料藥，從合成工藝路線考慮，在成品的質量控制中主要需要控制5 種異構體：對映異構體A、非對映異構體B、非對映異構體C，非對映異構體D 及非對映異構體E，替格瑞洛及需控制的異構體結構見圖1。文獻[2-3]提到了替格瑞洛及其部分異構體的測定方法，但是控制的異構體種類與本公司擬定的控制種類有差異，方法不適用。本研究建立依據擬定的雜質譜測定替格瑞洛異構體含量的方法，并參照《中國藥典》2020年版四部通則9101[4]和ICH Q2[5]要求進行方法學驗證。

圖1 替格瑞洛及需要控制的各異構體結構Fig.1 The structure of ticagrelor and the isomers that need to be controlled

1 儀器與試劑

1.1 儀器

XS105DU 型電子天平（Mettler Toledo 公司）；Waters e2695-2489 型高效液相色譜儀。

1.2 試藥與試劑

替格瑞洛對照品（自制，含量99.6%）；替格瑞洛原料藥（自制，含量99.1%）；異構體A 對照品（山東博洛德生物科技有限公司（下稱博洛德），純度為99.36%）；異構體B 對照品（博洛德，純度為98.85%）；異構體C 對照品（博洛德，純度為99.36%）；異構體DE 混合對照品（博洛德，純度為95.38%）；無水乙醇、正己烷和異丙醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Phenomenex Lux Cellulose -2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為無水乙醇-正己烷-異丙醇-二乙胺（體積比為55:40:5:0.5）；柱溫為20 ℃；檢測波長為300 nm；流速為1.0 mL/min；進樣體積為50 μL。

2.2 溶液的配制

（1）空白溶劑：異丙醇。

（2）供試品溶液配制：取本品適量，精密稱量，加溶劑溶解并定量稀釋制成每毫升含替格瑞洛0.25 mg 的溶液。

（3）對照液配制：精密量取供試溶液1.0 mL，置于100 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

（4）系統適用性溶液的配制：取替格瑞洛及異構體A、異構體B、異構體C、異構體DE 混合對照品各適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每毫升中含替格瑞洛0.25 mg、上述異構體2.5 μg 的溶液。

2.3 系統適用性要求與結果計算

系統適用性要求：替格瑞洛與異構體C 的分離度不小于2.0。單個異構體含量按式（1）計算。

單個異構體含量（%）=A異構體×f÷A對照×1%（1）

式（1）中：A異構體為供試液中各異構體峰的峰面積；f 為各異構體校正因子；A對照為對照液中主峰面積。

2.4 驗證試驗

2.4.1 專屬性

分別進樣空白溶劑、各個異構體的定位溶液及系統適用性溶液，系統適用性典型譜圖見圖2。從圖2 可知，空白溶劑不干擾待測物的測定，出峰順序依次為：異構體DE 第1 個峰（保留時間為9.609 min），異構體DE 第2 個峰（保留時間為10.834 min），異構體A（保留時間為13.368 min），異構體B（保留時間為15.103 min），異構體C（保留時間為24.148 min）和替格瑞洛（保留時間為29.498 min），替格瑞洛與異構體C 分離度為2.2。

圖2 系統適用性溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of system suitability solution

2.4.2 系統適用性

取系統適用性溶液，連續進樣6 次，異構體DE 第1 個峰的保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.50%，峰面積RSD 為1.30%；異構體DE 第2個峰的保留時間RSD 為0.43%，峰面積RSD 為1.22%；異構體A 的保留時間RSD 為0.34%，峰面積RSD 為0.97%；異構體B 的保留時間RSD 為0.31%，峰面積RSD 為1.15%；異構體C 的保留時間RSD 為0.20%，峰面積RSD 為1.37%；替格瑞洛的保留時間RSD 為0.18%，峰面積RSD 為1.20%。表明本方法的系統適用性良好。

2.4.3 靈敏度

精密稱取各異構體對照品，配制成混合溶液，逐級稀釋，進樣檢測，當信噪比為約10 左右作定量限。定量限測試結果：異構體DE 第1 個峰與第2 個峰的絕對檢測量均為2.5 ng，相對供試濃度均為0.02%；異構體A、異構體B 與異構體C的絕對檢測量均為5.0 ng，相對供試濃度均為0.04%。

2.4.4 線性與范圍

精密稱取各異構體和替格瑞洛對照品，配制成混合溶液，逐級稀釋，配制成相對供試品濃度在0.05%～0.25%的溶液6 份，依2.1 項下色譜方法檢測，以溶液中各組分的峰面積A 對相應的溶液濃度C 進行線性回歸，繪制標準曲線，結果如下：異構體DE 線性方程為y=72662x-523.62，范圍為0.1247～0.6233 μg/mL，r 為0.9991；異構體A的線性方程為y=86911x-349.56，范圍為0.1257～0.6286 μg/mL，r 為0.9999；異構體B 的線性方程為y=91471x-318.87，范圍為0.1231～0.6157 μg/mL，r為0.9996；異構體C 的線性方程為y=83972x-556.46，范圍為 0.1246～0.6228 μg/mL，r 為0.9998；替格瑞洛的線性方程為y=91443x+401.64，范圍0.1243～0.6215 μg/mL，r 為0.9995。

2.4.5 校正因子

采用各組分線性方程（y=kx+b）中斜率（k）的比值計算各異構體相對主成分的校正因子，公式為：f=k主成分/k異構體。一般情況下，校正因子在0.9～1.1 時可不予校正，即可以以1 計。各異構體的f計算結果：異構體DE：0.80、異構體A：0.95（以1計）、異構體B：1.00（以1 計）、異構體C：0.92（以1 計）。

2.4.6 精密度

由實驗員A 配制6 份供試品溶液，按照2.1項下色譜方法測定；由實驗員B 在不同的時間配制6 份供試品溶液，采用不同的儀器，依2.1 項下色譜方法測定，比較12 份樣品的檢測結果：實驗人員A 測定6 份供試品溶液，只檢出異構體C，含量在0.06%～0.07%之間，RSD 為6.6%，未檢出其他異構體；實驗人員B 測定6 份供試品溶液，只檢出異構體C，含量在0.05%～0.06%之間，RSD為9.1%，未檢出其他異構體；12 份供試品溶液異構體C 的RSD 為8.7%。表明本方法精密度良好。

2.4.7 準確度

精密稱取替格瑞洛原料藥適量，置于不同的9 個量瓶中，分別加入各異構體儲備液，配制成含替格瑞洛相對供試品溶液濃度為100%，各異構體相對供試品溶液濃度（報告限[6]濃度）為0.05%（平行3 份）、相對供試品溶液濃度（限度濃度）為0.15%（平行3 份）、相對供試品溶液濃度為0.25%（平行3 份）的溶液，按照2.1 項下色譜方法測定。9 份供試品溶液中，異構體DE 的平均回收率為92.8%，RSD 為3.6%；異構體A 的平均回收率為95.5%，RSD 為2.2%；異構體B 的平均回收率為102.7%，RSD 為4.3%；異構體C 的平均回收率為99.9%，RSD 為5.5%。表明本法準確度良好。

2.4.8 溶液穩定性

依法配制替格瑞洛供試品溶液與對照液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、48 h 進樣，考察穩定性。結果：對照溶液48 h 內主峰峰面積的RSD 為0.63%；供試品溶液48 h 內均只檢出異構體C，其含量的RSD 為0.0%。表明替格瑞洛供試品溶液與對照液在室溫條件下放置，在至少48 h內穩定。

2.4.9 耐用性

按照2.2 項下配制空白溶液、替格瑞洛供試品溶液、對照液及系統適用性溶液，微小改變色譜條件，按照2.1 項下色譜方法檢測，考察耐用性。各個測試條件下，空白溶劑對待測組分均無干擾，結果見表1。

表1 耐用性考察結果Tab.1 Durability test results

結果表明：微小改變流速、柱溫、流動相初始比例、使用不同批次色譜柱，不會對檢測結果造成影響，方法的耐用性良好。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法測定替格瑞洛原料藥中各異構體含量的方法。該方法能準確檢測替格瑞洛原料藥中替格瑞洛對映異構體A和其他非對映異構體雜質B、C、D、E，且方法靈敏度高，精密度好，能夠滿足替格瑞洛原料藥商業化生產中各異構體含量的檢測要求，更好地控制產品的質量。