跨膜蛋白26在視網膜中的特異表達及其與原發性開角型青光眼的關系

尹燚 冒瑤 楊正林 黃璐琳

電子科技大學醫學院 四川省人民醫院醫學檢驗中心 人類疾病基因研究四川省重點實驗室，成都610072

膜蛋白是一種功能性蛋白，在生物體內承擔著十分重要的作用，參與細胞增生分化、生長代謝、物質交換和能量轉化等生物過程。根據蛋白在膜上分離的難易程度，可將膜蛋白分為膜整合蛋白、膜錨定蛋白和外在膜蛋白?？缒さ鞍资悄ふ系鞍椎囊环N，在生物體內起著信號轉導、小分子物質或離子跨膜轉運等作用，其至少存在一段跨膜結構，因此將跨膜蛋白結構分為跨膜區、胞膜外區和胞質區，其結構對蛋白的功能具有重要作用?？缒さ鞍?6基因(transmembrane protein 26 gene，

TMEM26

)是含有6個外顯子的編碼跨膜蛋白的基因，在人和小鼠中均有表達，且均位于10號染色體上，該基因編碼一段相對分子質量約為41 600的多次跨膜蛋白。目前，已證明

Tmem26

在小鼠的胚胎中表達，且受時間和空間的調控；該基因在乳腺癌細胞中表達，其蛋白結構對細胞藥物治療應答存在影響；該基因也在氣道上皮和肺實質細胞中表達，是與肺功能下降、慢性阻塞性肺病發病機制相關的候選基因；TMEM26也被鑒定為一種米色脂肪細胞的表面標志物。雖然TMEM26已被報道在以上組織或細胞內表達，但其具體功能，尤其在眼中的作用及功能尚不清楚。青光眼是主要的致盲眼病之一，主要包括慢性閉角型青光眼、原發性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)和剝脫性青光眼等常見類型。視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)損失是青光眼的致病關鍵；內叢狀層(inner plexiform layer,IPL)由RGC樹突、雙極細胞軸突和無長突細胞形成的纖維網狀層組成，其厚度是評估POAG的潛在生物標志。本研究擬探討TMEM26在視網膜中的表達情況，并根據本課題組已報道的數據探討

TMEM26

基因變異與POAG的關聯情況。

1 材料與方法

1.1 材料

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材料來源 選取SPF級21周齡健康C57BL/6小鼠5只，體質量為25～31 g，由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供，實驗動物的喂養及使用均遵循《實驗動物管理條例》。1個人眼球來自于遺體捐贈。本研究獲四川省人民醫院倫理委員會批準[批文號：倫審(研)2019年第36號]，人體標本的來源與使用均獲得捐贈者家屬簽字同意。

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主要試劑及儀器 質量分數4%多聚甲醛通用型組織固定液(北京Biosharp公司)；質量分數30%蔗糖溶液、體積分數0.25% Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司)；OCT冷凍切片包埋劑(美國Sakura公司)；兔抗TMEM26多克隆抗體(TA330777，美國Origene公司)；Isolenctin B4 594(英國MKBio公司)；體積分數5%山羊血清、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔熒光二抗、DAPI、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(上海碧云天生物技術有限公司)。解剖顯微鏡(SZX10，日本Olympus公司)；顯微解剖器械(深圳華陽生物技術有限公司)；冰凍切片機(BK-2318，山東博科生物產業有限公司)；恒溫烘箱(DHP-9052，上海和呈儀器制造有限公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM800，德國Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

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蛋白跨膜結構預測 從UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中獲得人和小鼠的TMEM26氨基酸序列，將氨基酸序列輸入MemBrain 3.0中，預測跨膜結構。

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免疫熒光染色法觀察TMEM26在人和小鼠視網膜中的表達及定位 在解剖顯微鏡下剪去角膜，用4%多聚甲醛完全浸沒眼球，固定2 h后用PBS洗去殘留的多聚甲醛；在解剖顯微鏡下用鑷子輕輕取出晶狀體，將取出晶狀體后的眼球用30%蔗糖浸沒，脫水2 h，將其取出用OCT包埋劑包埋。將包埋好的組織置于-80 ℃冰箱，用于冰凍切片。切片制作完成后，將其在37 ℃烘箱中烘烤1 h，使組織切片完全固定于載玻片，用免疫組化筆圈出切片位置，使用含5%山羊血清和0.25% Triton X-100的PBS溶液封閉1 h；使用兔抗TMEM26多克隆抗體(1∶ 200)4 ℃避光孵育過夜；使用Alexa-488山羊抗兔二抗(1∶ 500)及DAPI避光孵育2 h；PBS清洗，封片后采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

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免疫熒光雙重染色法觀察TMEM26與血管定位關系 參照1.2.2方法行TMEM26免疫熒光染色，進行視網膜Isolectin B4血管內皮細胞標記染色，加入Isolectin B4(1∶ 200)，4 ℃避光孵育過夜；用PBS沖洗10 min，封片后激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，藍色為DAPI，綠色為TMEM26，紅色為視網膜血管。

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TMEM26

基因的SNP分析 與本課題組前期研究結果的數據進行比對，分析

TMEM26

在1 007例POAG患者與1 009個正常人的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)變異情況，總結數據，篩選出

P

<0.01的顯著性變異。

1.3 數據處理

采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UCSC等網站查詢

TMEM26

基因和蛋白的信息；通過MemBrain 3.0跨膜結構預測網站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/MemBrain/)預測蛋白的跨膜結構。使用DNAMAN進行氨基酸序列比對，通過AI編輯跨膜蛋白圖像。

2 結果

2.1 TMEM26跨膜結構

在UCSC中查詢人TMEM26的氨基酸殘基有368個，小鼠Tmem26的氨基酸殘基有366個。將2種來源的TMEM26進行氨基酸序列比對，同源率為69.46%。人TMEM26蛋白包括8個疏水性跨膜結構域、4個親水胞質結構域和5個親水胞膜外區結構域；且有2個螺旋跨膜結構連接的親水性胞質結構氨基酸殘基數僅有2個，是小胞質結構域。小鼠Tmem26蛋白預測結果與人TMEM26相似，同樣含有8個跨膜結構域、5個親水胞膜外區結構域和4個親水胞質結構域。人和小鼠TMEM26多肽鏈N-端和C-端均位于胞膜外，具有相似的跨膜結構域、胞膜外結構域和胞質結構域，整體跨膜結構相似。但兩者的結構域氨基酸殘基組成數存在細微差別，對于2個“背靠背”(back-to-back)螺旋跨膜結構，在人的TMEM26中，第1個back-to-back螺旋跨膜結構由E2-V30的29個氨基酸殘基組成，第2個back-to-back螺旋跨膜結構由E33-K57的25個氨基酸殘基組成；小鼠Tmem26中的2個back-to-back螺旋跨膜結構分別由E2-K31的30個氨基酸殘基、H34-K57的24個氨基酸殘基構成。此外，氨基酸殘基數目差別最大的是位于多肽末端的胞膜外結構域，人的TMEM26比小鼠的Tmem26多2個氨基酸殘基(圖1，表1)。

圖1 人與小鼠TMEM26的跨膜結構 藍色所示為“背靠背”螺旋跨膜結構，黃色為非“背靠背”螺旋跨膜結構 A：人 B：小鼠Figure 1 Transmembrane structure of TMEM26 protein in human and mouse The color blue presented back-to-back transmembrane helices,and the color yellow showed non-back-to-back transmembrane helices A:Human B:Mouse

表1 TMEM26蛋白跨膜結構具體位置[12-16]Table 1 Specific amino acid sequences of transmembrane structure of TMEM26 protein人TMEM26蛋白跨膜結構 小鼠Tmem26蛋白跨膜結構氨基酸殘基順序位置氨基酸殘基順序位置1-1胞膜外區1-1胞膜外區2-30跨膜區2-31跨膜區31-32胞質區32-33胞質區33-57跨膜區34-57跨膜區58-65胞膜外區58-65胞膜外區66-88跨膜區66-88跨膜區89-143胞質區89-143胞質區144-162跨膜區144-162跨膜區163-172胞膜外區163-174胞膜外區173-192跨膜區175-192跨膜區193-204胞質區193-204胞質區205-219跨膜區205-219跨膜區220-252胞膜外區220-252胞膜外區253-278跨膜區253-279跨膜區279-285胞質區280-286胞質區286-311跨膜區287-311跨膜區312-368胞膜外區312-366胞膜外區 注:TMEM26:跨膜蛋白26;氨基酸殘基順序為N端-C端,位置是相對于膜的位置 Note:TMEM26:transmembrane protein 26;The sequence of amino acid residue was N-terminal to C-terminal,and the position was relative to cell membrane

2.2 TMEM26在視網膜中的表達

在人視網膜中，TMEM26主要在視網膜的外叢狀層(outer plexiform layer,OPL)和IPL特異性表達，且不在細胞核內表達(圖2)。在小鼠的視網膜切片中，Tmem26的表達情況與人視網膜的表達情況相似，主要表達在視網膜的OPL和IPL，且不在細胞核內表達(圖3)。Isolectin B4染色結果顯示，Tmem26不在血管細胞中表達(圖4)。

圖2 TMEM26在人視網膜中的表達 TMEM26陽性細胞呈綠色熒光(Alexa Fluor 488)，細胞核呈藍色熒光(DAPI) A：TMEM26在視網膜的整體表達情況 主要在OPL和IPL表達(×400，標尺=50 μm) B：TMEM26在OPL的表達情況(×630，標尺=7.5 μm) C：TMEM26在IPL的表達情況(×630，標尺=7.5 μm) DAPI：4’,6-二脒基-2苯基吲哚；TMEM26：跨膜蛋白26；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內核層；IPL：內叢狀層；GCL：神經節細胞層Figure 2 Expression of TMEM26 in human retina TMEM26-positive cells showed green fluorescence (Alexa Fluor 488),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI) A:Distribution of TMEM26 in human retina TMEM26 was mainly expressed in OPL and IPL (×400,bar =50 μm) B:Expression of TMEM26 in OPL (×630,bar=7.5 μm) C:Expression of TMEM26 in IPL (×630,bar=7.5 μm) DAPI:4’,6-diamidino-2-phenylindole;TMEM26:transmembrane protein 26;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer;GCL:ganglion cell layer

圖3 Tmem26在小鼠視網膜中的表達 Tmem26陽性細胞呈綠色熒光(Alexa Fluor 488)，細胞核呈藍色熒光(DAPI) A：Tmem26在視網膜的整體表達情況 主要在OPL和IPL表達(×400，標尺=25 μm) B：Tmem26在OPL的表達情況(×630，標尺=7.5 μm) C：Tmem26在IPL的表達情況(×630，標尺=10 μm) DAPI：4’,6-二脒基-2苯基吲哚；Tmem26：跨膜蛋白26；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內核層；IPL：內叢狀層；GCL：神經節細胞層Figure 3 Expression of Tmem26 in mouse retina Tmem26-positive cells showed green fluorescence (Alexa Fluor 488),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI) A:Distribution of Tmem26 in mouse retina Tmem26 was mainly expressed in OPL and IPL (×400,bar=25 μm) B:Expression of Tmem26 in OPL (×630,bar=7.5 μm) C:Expression of Tmem26 in IPL (×630,bar=10 μm) DAPI:4’,6-diamidino-2-phenylindole;Tmem26:transmembrane protein 26;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer;GCL:ganglion cell layer

圖4 小鼠視網膜Tmem26蛋白與血管定位關系(×200，標尺=25 μm) Tmem26陽性細胞呈綠色熒光(Alexa Fluor 488)，小鼠視網膜血管呈紅色熒光(GS-IB4)，細胞核呈藍色熒光 (DAPI),顯示Tmem26在小鼠血管細胞中未見表達Figure 4 The co-location of Tmem26 protein and vessels in mouse retina (×200,bar=25 μm) Tmem26-positive cells showed green florescence (Alexa Fluor 488),and mouse retinal vessels were red fluorescence (GS-IB4),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI).Tmem26 was not expressed in vessel cells of mouse

2.3 TMEM26基因的SNP分析與POAG關聯情況

由于TMEM26蛋白在視網膜中的表達集中在IPL及OPL，比較特殊，為了探討該基因是否與眼病有關，我們基于本課題組已發表的全基因組關聯分析數據，探討了

TMEM26

與POAG的關系。在1 007例具有高眼壓特征的POAG患者樣本與1 009例正常人樣本的關聯分析結果中，發現

TMEM26

區域的26個SNP位點，與POAG存在弱相關性(

P

<0.05)，其中10:63203054位點信號最強(

P

=0.001 7，

OR

=0.76)，提示該區域對POAG可能具有弱保護作用(表2)。

表2 10號染色體上TMEM26基因在1 007例POAG患者與1 009例正常人中的變異情況Table 2 Variation of TMEM26 gene in chromosome 10 among 1 007 POAG cases and 1 009 healthy controls SNPBPA1F_AF_UA2CHISQPORSEL95U9510:6317799163177991T0.197 90.231 6C6.7520.009 3630.818 50.077 130.703 70.952 110:6319240763192407A0.277 60.318 6AT8.0620.004 5200.821 70.069 200.717 50.941 110:6319241463192414TA0.282 60.322 1AA7.4120.006 4800.829 00.068 900.724 30.948 910:6320305463203054C0.130 80.166 0CA9.8450.001 7030.755 80.089 430.634 30.900 610:6320579163205791C0.199 40.233 1T6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6320616163206161G0.199 40.233 1C6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6320636163206361A0.199 40.233 1G6.7140.009 5680.819 40.076 930.704 70.952 810:6321609363216093T0.197 90.233 1A7.3440.006 7280.811 70.077 050.697 90.944 010:6322121463221214T0.073 20.097 4C7.5620.005 9630.731 20.114 200.584 60.914 610:6322176863221768T0.194 40.230 1C7.6490.005 6810.807 30.077 490.693 50.939 710:6323073863230738A0.196 90.231 6T7.1720.007 4060.813 40.077 210.699 10.946 210:6323203863232038T0.196 90.232 1C7.3720.006 6240.811 10.077 180.697 20.943 610:6323367163233671C0.259 50.299 2G7.8370.005 1180.820 90.070 550.714 90.942 610:6323694163236941T0.196 90.231 6G7.1720.007 4060.813 40.077 210.699 10.946 210:6324080463240804G0.196 90.231 1GA6.9740.008 2710.815 60.077 240.701 10.948 910:6324835863248358A0.196 90.231 1G6.9740.008 2710.815 60.077 240.701 10.948 910:6325700263257002C0.209 90.247 0T7.8210.005 1630.809 90.075 450.698 60.939 010:6325949563259495T0.209 90.247 0C7.8210.005 1630.809 90.075 450.698 60.939 010:6326487263264872C0.195 90.233 6T8.4460.003 6580.799 30.077 180.687 10.929 810:6326763063267630T0.207 40.244 5TA7.8910.004 9690.808 50.075 750.696 90.937 910:6327096963270969A0.207 40.244 0C7.6870.005 5630.810 70.075 770.698 80.940 510:6327194663271946AT0.206 90.244 0A7.9050.004 9310.808 20.075 810.696 60.937 710:6328004663280046C0.205 90.243 0G7.9330.004 8540.807 60.075 930.695 90.937 210:6328162763281627A0.200 40.238 6G8.5180.003 5160.799 90.076 570.688 40.929 410:6328684863286848C0.194 90.232 6A8.4780.003 5940.798 60.077 310.686 30.929 310:6328685963286859A0.196 40.233 1C8.0050.004 6650.804 00.077 170.691 20.935 3 注:TMEM26:跨膜蛋白26;POAG:原發性開角型青光眼;SNP:單核苷酸多態性;BP:堿基對位置(Hg19);A1:第一等位基因編碼;F_A:病例等位基因頻率;F_U:對照等位基因頻率;A2:第二等位基因編碼;CHISQ:非隨機缺失的χ2檢驗;P:固定效應元分析P值;OR:固定效應評估值;SE:系數的標準差;L95:CMH檢驗優勢比置信區間的下界;U95:CMH檢驗優勢比置信區間的上界(數據來源于文獻[11]原始數據集) Note:TMEM26:transmembrane protein 26;POAG:primary open-angle glaucoma;SNP:single nucleotide polymorphism;BP:base pairs (Hg19);A1:base of major allele;F_A:allele frequencies of affected patients;F_U:allele frequencies of healthy controls;A2:base of minor allele;CHISQ:χ2 test;P:P value of fixed effect meta-analysis;OR:assessed value of the fixed effects;SE:standard error of coefficient;L95:lower confidence interval for the odds ratio in Cochran-Mantel-Haenszel test;U95:upper confidence interval for the odds ratio in Cochran-Mantel-Haenszel test (Data were from the original data set of reference 11)

3 討論

TMEM26是跨膜蛋白家族中的一員，亞細胞定位于細胞膜上，通過免疫組織化學染色觀察到該蛋白在細胞質側表達，不在細胞核內表達，其表達模式推測可能為突觸，具有分泌神經遞質的作用。膜蛋白對于物質轉運、受體識別等具有重要意義，尤其是跨膜蛋白。多次跨膜的跨膜蛋白的跨膜結構通?？梢孕纬晌镔|轉運通道；起連接作用的跨膜蛋白的親水性結構域通常也具有調控作用，如通道開關和蛋白招募等，因此研究跨膜蛋白的跨膜結構對于理解和探討跨膜蛋白的功能具有重要意義。人和小鼠TMEM26跨膜結構的比較可為動物實驗部分的研究提供依據，并為最終結合到人的眼病提供參考。人和小鼠TMEM26蛋白結構的細微差別可能表示兩者的調控作用以及對于物質的轉運存在某些差別，但其具體意義仍需進一步研究。目前對

TMEM26

的研究相對較少，作為蛋白編碼基因，最常見的轉錄本是由6個外顯子構成的約6 kb的mRNA。除此之外，還有額外的轉錄本，如在小鼠中，

Tmem26

基因外顯子2和外顯子3之間還存在一段82 bp的外顯子2a，插入外顯子2a會導致移碼突變，其最終結果是在外顯子3中引入早期終止密碼子，使得翻譯提前終止，從而導致

Tmem26

表達異常。

蛋白結構對蛋白功能具有重要意義，如是否存在N-端信號肽和C-端結構域的數量等都將影響蛋白功能。TMEM26已被證實在Jurkat T細胞和乳腺癌細胞中是一種N-糖基化蛋白，這種N-糖基化修飾的TMEM26在質膜上的保留時間比非糖基化修飾的TMEM26更長，證明N-糖基化的TMEM26在質膜上具有重要功能。Hansel等通過Western blot在人乳腺癌細胞中檢測出TMEM26的幾種同工蛋白，主要包括含有368個氨基酸的非N-糖基化蛋白p40，以及主要的2種通過N-糖基化修飾形成的同工型蛋白p44和p53。由于蛋白結構復雜，預測的8次跨膜結構可能存在一定的誤差，如Town等和Yuan等預測Tmem26蛋白偏向于7次跨膜。TMEM26具體的跨膜結構仍有待進一步研究。TMEM26是米色脂肪細胞的表面標志物，將白色脂肪組織褐變分化成米色脂肪組織是肥胖癥十分有效的治療手段，其可改善肥胖癥患者葡萄糖和脂質代謝，及改善人類免疫缺陷病毒感染患者的心臟代謝健康,可用于檢測促褐變藥物的米色細胞的增量效果。通過GWAS分析發現，TMEM26與睡眠深度、紫杉烷對肺癌的治療、抗精神病藥氯氮平對精神分裂癥的治療、歐美人群兒童對食物過敏、二異氰酸酯哮喘發病機制和血壓升高等方面均存在相關性。然而對TMEM26在視網膜中的功能研究較少。

位于RGC層的RGC與感光細胞之間有2層神經氈，即OPL和IPL，在OPL感光細胞與縱向的雙極細胞連接，在IPL橫向的水平細胞與神經節細胞連接。RGC通過樹突與OPL和IPL的中間神經細胞形成突觸，并連接到光感受器。感光細胞負責接受光刺激，將光信號傳遞給神經細胞，并由此經視神經傳遞給中樞神經，從而產生視覺影像。本研究結果顯示，TMEM26在人和小鼠視網膜OPL和IPL中特異性表達。因此，進一步研究TMEM26的功能，特別是其對視網膜以及視覺方面的影響具有重要意義。

根據TMEM26在視網膜OPL和IPL中的特異表達情況，推測其表達模式主要為突觸表達，可能具有分泌神經遞質的作用，其分泌的神經遞質可能會對RGC或視神經造成影響?；诮Y果顯示TMEM26在IPL表達最高，且IPL厚度與POAG顯著相關，推測該基因可能與POAG有關。檢索本課題組已有數據發現TMEM26與POAG呈弱相關，但其突變具體的影響機制尚有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示，TMEM26在視網膜IPL和OPL表達，且在IPL表達最高，通過該基因的SNP和外顯子測序結果均顯示TMEM26與POAG呈弱相關。下一步我們將構建

Tmem26

敲除小鼠，從模式生物角度來研究該基因或蛋白的功能。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明

尹燚：參與選題與實驗設計、實驗操作、數據整理、統計分析、論文撰寫及修改；冒瑤：實驗操作、數據整理；楊正林：工作支持、實驗指導；黃璐琳：參與選題與設計實驗、實驗指導、論文修改及定稿、經費支持