基于網藥學方法探究透膿散治療慢性骨髓炎的分子作用機制

郭光鑫　孫穎　欒海鵬　管東輝

摘要 目的：使用中藥復方網絡藥理學技術探討透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫搜索透膿散中黃芪、當歸、川芎、皂角刺中所含有的化合物（因目前國家對于穿山甲稀有動物的保護，為響應國家號召，未進行穿山甲化合物的采集），篩選出透膿散中藥物的符合要求的活性成分及作用靶點;通過人類基因數據庫（GeneCards）搜索慢性骨髓炎的靶點信息;使用Cytoscape分析軟件進行“藥物-化合物-靶點”分析，導入功能蛋白聯系網絡數據庫（STRING）行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的分析，之后使用DAVID數據庫進行Gene ID轉換，差異基因的功能、通路富集分析等。結果：篩選后共獲得透膿散治療慢性骨髓炎的431個相關成分和227個靶點信息;慢性骨髓炎的相關靶點信息438個;PPI網絡46個核心蛋白，關鍵涉及白細胞介素-10、白細胞介素-6、MMP9、TP53等;獲得GO生物過程368條，主要涉及細胞增殖、免疫、炎癥反應、細胞凋亡;KEGG信號通路88條，涉及破骨細胞分化、瘧疾、甲型流感、類風濕性關節炎、核因子κB以及TNF信號通路。結論：透膿散可能通過控制細胞凋亡、免疫炎癥反應等途徑對慢性骨髓炎發揮治療作用，通過分析為透膿散治療慢性骨髓炎提供微觀層面的理論信息支持。

關鍵詞 透膿散;網絡藥理學;慢性骨髓炎;信號通路;作用機制

Exploration of Molecular Action Mechanism of Tounong Powder in the Treatment

of Chronic Osteomyelitis Based on Pharmacy Network

GUO Guangxin，SUN Ying，LUAN Haipeng，GUAN Donghui

（1 The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 School of

Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 3 Affiliated Hospital

of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the potential action mechanism of Touyu Powder in the treatment of chronic osteomyelitis by using Chinese herbal compound network pharmacology technology.Methods：Through the database of the Laboratory of Computational Systems Biology（TCMSP），we searched for compounds contained in Astragalus，Angelica，Ligusticum chuanxiong and Saponaria japonicus in Toupu Powder（Due to the current national protection of rare pangolin animals，in response to the call of the country，no collection of pangolin compounds has been carried out）.We screened out the active ingredients and target of action of the drugs in Touyu Powder; we searched for the target information of chronic osteomyelitis through the human gene database（GeneCards）; used Cytoscape analysis software to perform “drug-compound-target” analysis，imported the functional protein connection network database（STRING） to analyze the protein interaction network，and then used the DAVID database for Gene ID conversion，differential gene function，pathway enrichment analysis，etc.Results：After screening，a total of 431 related components and 227 target information for the treatment of chronic osteomyelitis by Touyu Powder were obtained; related target information for chronic osteomyelitis was 438; there were 46 core proteins of protein interaction network.The key was related to interleukin 10，interleukin 6，and interleukin 6 MMP9，TP53，etc.; we obtained 368 GO biological processes，mainly related to cell proliferation，immunity，inflammation，apoptosis; there were 88 KEGG signaling pathways，related to osteoclast differentiation，malaria，influenza A，rheumatoid arthritis，NF-kB and TNF signaling pathway.Conclusion：Touyu Powder may have a therapeutic effect on chronic osteomyelitis by controlling cell apoptosis and immune inflammatory response.The analysis of this paper provides microscopic theoretical information support for the treatment of chronic osteomyelitis with Touyu Powder.

Keywords Touyu Powder; Network pharmacology; Chronic osteomyelitis; Signaling pathway; Mechanism action

中圖分類號：R289.5;R274.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.004

慢性骨髓炎是一種骨的慢性感染性疾病，多見于骨折手術之后、糖尿病控制不佳的嚴重并發癥、血源性骨感染等。其可見反復發作病史、非特異性疼痛、皮膚色素沉著、顏色異常、健側患側不對稱性腫脹，有的甚至可能會出現竇道[1]。臨床上的慢性骨髓炎并不少見，盡管隨著外科手術技術的進步以及抗生素治療水平的逐漸提高，骨髓炎的治療較之前有很大提高，但是隨著臨床上抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等一些耐藥菌，依然是令骨科醫生頭疼的問題。目前的骨髓炎的手術治療多采用的是感染骨段切除加骨搬運以及各種帶萬古霉素植入術，且一般需長期使用抗生素，對于肝腎損害很大，會出現耳毒癥、消化道反應、免疫變態反應、“紅人綜合征”以及血液成分異常等不良反應[2]。慢性骨髓炎在中醫學中稱為“附骨疽”，多由于患者在感受疔瘡癤癰等毒、麻疹、傷寒等疾之后，余毒未清，伏結于內，久而入骨成疽;或因外傷，血瘀氣滯，積瘀成疽，聚毒而為病[3]。最初記載于《諸病源候論》：“附骨癰……與熱氣相搏，伏結近骨成疽……謂之附骨癰也?！?/p>

透膿散，始出《外科正宗》，記載可治癰瘡諸毒，內膿不透之病。方由當歸、穿山甲、皂角刺、黃芪、川芎等五味藥組成。生黃芪補氣升陽、托毒排膿，為瘡家之圣藥;當歸補血和血，祛體內之積血;川芎補血活血，養新血破積血，行血中之氣，二者常合用來養血合營。皂角刺可托毒排膿、引藥上行，助黃芪透散之力，直達病所，消脈絡之積，祛陳腐之氣。全方合用共奏補虛脫毒、潰瘡透膿之效。目前臨床上常用透膿散治療慢性骨髓炎，在長期的臨床實踐中效果顯著[4-5]。本研究運用中藥復方網絡藥理學的方法篩選透膿散中部分藥物的活性化合物及其作用靶點，形成“藥物-化合物-靶點”，并預測信號通路，分析透膿散治療慢性骨髓炎的相關分子機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選 借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別以“黃芪”“當歸”“皂角刺”“川芎”檢索透膿散中部分中藥活性化合物成分，其中因穿山甲為國家保護動物，且2020年《中華人民共和國藥典》也將穿山甲移除，為遵守國家相關動物保護條例，防止出現因藥物特殊療效引起的穿山甲捕殺情況，未對其進行檢索分析。根據藥物的吸收、分布、代謝和排泄原則，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）越高，類藥性（Drug Likeness，DL）越高。結合以往文獻選取OB≥30%、DL≥0.18為標準[6]，篩選出黃芪、當歸、皂角刺、川芎的活性化合物中符合標準的成分進行分析。

1.2 藥物作用疾病靶點篩選 通過TCMSP檢索篩選得到的活性化合物成分，查找靶點蛋白，運用Uniprot蛋白質數據庫查詢所有靶點蛋白所對應的genename，并合并重復值，刪除無對應genename的靶點蛋白。運用Cytoscape 3.7.2分析并構建“藥物-化合物-靶點”。

1.3 靶點間相互作用分析 在疾病靶點數據庫中檢索“Chronic osteomyelitis”相關疾病基因[7]。將之前得到的藥物靶點和疾病靶點進行映射，所得的交集部分作為透膿散治療慢性骨髓炎的潛在治療靶點。將上述得到的潛在靶點從STRING數據庫[8]以“Homo Sapiens”為界定進行分析，得到蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）關系，并應用Cytoscape分析得到核心作用靶點。

1.4 作用機制圖繪制及預測 分析篩選出來的潛在作用靶點基因、信號通路，應用DAVID數據庫，以P<0.05，物種“Homo Sapiens”，進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析[9]。GO富集分析選用Biological process、Molecular function、Cellular components按照其靶點數目進行排序，選取富集的前20條，并繪制氣泡圖，通過Omicshare云平臺繪制KEGG通路富集。

2 結果

2.1 藥物活性成分 根據OB≥30%、DL≥0.1得到透膿散中化合物共431個，包括異黃酮、福莫寧等。表1為透膿散部分活性化合物。

2.2 藥物作用靶點 運用Cytoscape 3.7.2軟件構建圖1的透膿散中“藥物-活性化合物-靶點”網絡。

2.3 透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用靶點的預測 通過GeneCards數據庫檢索到438個慢性骨髓炎的潛在靶點。制作交叉驗證靶標韋恩圖，共得到46個交集靶點，將這46個靶點視為“透膿散”治療慢性骨髓炎的預測靶點。見圖2。

2.4 靶PPI網絡分析 將透膿散治療慢性骨髓炎的46個交集靶點輸入STRING數據庫分析，利用Cytoscape 3.7.2軟件進行靶PPI網絡分析，靶點Degree值越大，形狀越大，顏色越深，平均節點度值為26.09，其中度值大于24的靶蛋白有32個，表明這幾個靶點在韋恩網絡中起了關鍵作用，可以作為透膿散治療慢性骨髓炎的重要預測靶點。見圖3。篩選出網絡中排名前10的關鍵節點，關鍵節點網絡見圖4，詳細信息見表3。

2.5 GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析 將46個潛在靶點提交DAVID數據庫中，按照P<0.05進行篩選，選取富集基因前20進行分析，其中涉及368個生物過程（Biological Process，BP）（圖5）、43種分子功能（Molecular Function，MF）（圖6）和22類細胞組分（Cellular Component，CC）（圖7）。主要涉及細胞增殖、免疫、炎癥反應、細胞凋亡、毒性反應、蛋白質結合、細胞因子活性、相同的蛋白結合、蛋白均二聚活性、蛋白異二聚體活性、細胞外空間、細胞質、膠質溶膠、細胞外泌體、線粒體基因等。

將46個潛在靶點提交DAVID數據庫中，按照P<0.05篩選，進行KEGG通路富集分析，涉及88條信號通路，主要涉及類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、破骨細胞分化、瘧疾、甲型流感、核因子κB信號通路、TNF信號通路等。繪制排名前20的氣泡圖。見圖8。根據蛋白質與信號通路之間的關系，選取關鍵靶點，借助Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“靶點-通路”圖。見圖9。綠色菱形為通路，紅色圓形為靶點。

3 討論

慢性骨髓炎是骨科臨床上并不少見的慢性骨感染性疾病，無明顯年齡發病特點，任何行骨折手術治療的患者都有可能發生，多為急性骨髓炎的延續，易復發。其治療失敗可能導致骨折內固定失敗、死骨和竇道形成、長期排膿、甚至惡變等嚴重后果，影響

患者的身體健康、生命質量，對患者造成巨大的精神負擔和經濟負擔[10]。目前常用的治療方式多為高級抗生素配合下的手術治療[11-14]，但手術的缺點是次數多、創傷大、患者的心理壓力較大，并且一般會出現抗生素的不良反應。有臨床治療經驗及臨床觀察表明，透膿散可以有效消除局部病灶癥狀，改善身體整體狀況，加速愈合，并有效預防復發[4-5，15]。

本研究結果表明，透膿散中包含431個化合物，40個活性成分，227個作用靶點，透膿散治療慢性骨髓炎的潛在作用靶點195個，篩選得到46個關鍵化合物，根據中心度值及等級值，從高到低依次是槲皮素、山柰酚、谷甾醇、豆甾醇、fisetin，其中槲皮素的度值最高為285。槲皮素可以抗炎癥反應、抗病毒、抗腫瘤、降低血糖及免疫調節等作用[16]。Britti等[17]發現槲皮素聯合棕櫚酰乙醇酰胺可以大大改善大鼠關節炎模型的活動度、疼痛指數、組織學評分，還可通過降低TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達發揮治療關節炎的作用。李陽等[18]發現，槲皮素對肝臟氧化損傷有保護作用。山柰酚具有抗癌細胞、治療糖尿病、保護損傷細胞等功能，并且可以調節Ca代謝，促進膠原產生，減少骨小梁丟失間接治療骨質疏松，因此山柰酚對于慢性骨髓炎造成的骨丟失可能會有一定的幫助作用[19-20]。谷甾醇、豆甾醇是常見植物甾醇，具有抵抗炎癥、參與免疫調節。Chen等[21]在大鼠OA模型中發現豆甾醇能夠降低軟骨降解，并顯著抑制基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）的表達，可能被認為是一種治療關節炎的可行藥物;并且豆甾醇還具有抗氧化、抗腫瘤、鎮痛以及治療糖尿病的作用[22]。fisetin可以影響細胞內血紅素加氧酶（Heme Oxygenase，HO）-1的表達，清除細胞內活性氧，通過減少氧化損傷，從而對于細胞起到一定的保護作用，對于慢性病有一定的預防作用[23]。

透膿散在治療慢性骨髓炎的PPI網絡結果分析中，其中46個核心靶點蛋白中IL-6、AKT1、VEGFA、MMP9、TP53等靶點是透膿散治療慢性骨髓炎的主要作用靶點。IL6是主要的炎癥介質，也是骨性關節炎等發病的重要介質，參與炎癥反應的調節[24]。蛋白激酶（AKT1）同樣也是參與炎癥反應的物質之一，有研究表明，上調OA模型大鼠的微小RNA-543，可以促進軟骨細胞增殖，拮抗IL-1β誘導的軟骨細胞損傷，下調鼠雙微體（Mouse Double Minute4，MDM4）表達、上調AKT1、Bcl-2等的表達，減少炎癥介質的產生，并且AKT1對于對抗軟骨細胞的損傷也有一定的作用[25-26]。血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）具有抗成骨細胞凋亡，維系成骨細胞的成活促進局部成骨的作用[27]。另外，VEGF的表達還與滑膜炎癥、軟骨變性及軟骨細胞凋亡等密切相關[28]。MMP是具有降解幾乎所有細胞外基質功能的酶，存在于正常人體內，參與傷口愈合、軟骨基質降解、骨吸收過程，該物質的減少也可以減少炎癥介質的釋放，調整異常的基質降解和血管形成等，從而起到炎癥緩解、減少軟骨和骨質破壞[29]。腫瘤蛋白P53則參與癌癥細胞凋亡，參與抑癌細胞的侵襲遷移及細胞凋亡過程[30]。

GO富集分析主要涉及細胞增殖、免疫、炎癥反應、細胞凋亡等。KEGG主要涉及類風濕關節炎、瘧疾、甲型流感、破骨細胞分化、核因子κB信號通路、TNF信號通路。而進一步分析可以看出，核因子κB信號通路、TNF信號通路均涉及到類風濕性關節炎、破骨細胞分化，二者通過相互作用，抑制炎癥介質的釋放和成骨細胞的分化[31-32]，并且TNF信號通路還可以介導炎癥介質TNF-α，抑制滋養細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡。核因子κB通過對多種基因表達的調節，影響機體免疫反應，從而在機體免疫功能調節中發揮重要作用。由此分析可以得出，核因子κB信號通路、TNF信號通路可以通過抑制炎癥介質釋放以及免疫調節作用達到炎癥緩解的作用，增加機體免疫力等，以達到緩解或治療慢性骨髓炎的效果。

綜上所述，通過分析預測，該中藥復方可能通過細胞增殖、凋亡、免疫炎癥反應等方面發揮治療作用，通過該分析，可以將透膿散作為治療慢性骨髓炎的一種長期服用藥物，大大降低了長期應用抗生素對于機體的不良影響。但是本研究有一定局限性，對于中藥的反應因人而異、要嚴格辨證論治，另外因數據庫數據不全或者篩選原因以及某些珍貴稀有藥物的原因，造成了某些中藥未進行檢索等。因此詳細的治療機制和臨床療效仍需要臨床去驗證。

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（2020-07-28收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項目：山東省中醫藥科技發展計劃項目（2019-0144）

作者簡介：郭光鑫（1995.08—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫骨傷科學，E-mail：962246009@qq.com

通信作者：管東輝（1974.07—），男，博士，副主任醫師，研究方向：中醫骨傷科學，E-mail：guanyisheng0720@163.com