從網絡藥理學角度研究白芍治療類風濕關節炎的作用

鄭春松　黃綏心　葉蕻芝　葉錦霞　徐筱杰

【摘 要】目的：從分子水平揭示白芍治療類風濕關節炎的作用。方法：從北京大學天然產物庫中搜索白芍的化學成分，通過分子對接和生物網絡技術，研究白芍化合物與類風濕關節炎相關通路重要靶點的相互作用。結果：模擬篩選出來白芍有效成分群25個化合物，為苷類、多酚類、黃酮類和有機酸類化合物，能與p38 MAPK、JNK和PI3K-AKT信號通路中重要靶點p38、JNK-1、JNK-3、PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ有相互作用。結論：網絡藥理學直觀顯示了白芍治療類風濕關節炎的多成分、多靶點和多通路作用，為后續從白芍中開發出治療類風濕關節炎的新藥提供了依據。

【關鍵詞】 關節炎，類風濕；白芍；網絡藥理學；分子對接

On the Role of Baishao in the Treatment of Rheumatoid Arthritis from the Viewpoint of Network Pharmacology

ZHENG Chun-song，HUANG Sui-xin，YE Hong-zhi，YE Jin-xia，XU Xiao-jie

【ABSTRACT】Objective：To reveal the role of Baishao（Radix Paeoniae Alba）in the treatment of rheumatoid arthritis at the molecular level.Methods：The chemical constituents of Baishao were searched from the Universal Natural Products Database of Peking University.The molecular docking and biological network techniques were used to study the interaction between the compounds of Baishao and the important targets of related pathways of rheumatoid arthritis.Results：Twenty five compounds of the effective constituents in Baishao selected by simulation，such as glycosides，polyphenols，flavonoids and organic acids，could interact with important targets of p38，JNK-1，JNK-3，PI3Kα and PI3Kβ and PI3Kδ in the signaling pathways of p38 MAPK，JNK and PI3K-AKT.Conclusion：Network pharmacology explicitly shows the multi-component，multi-target and multi-channel effects of Baishao on rheumatoid arthritis，providing a basis for the development of new drugs for the treatment of rheumatoid arthritis in Baishao.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；Baishao；network pharmacology；molecular docking

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜為主要靶組織的慢性全身性自身免疫性疾病[1]?，F代醫學治療RA采用非甾體抗炎藥、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、地塞米松等。這些藥物長期服用具有胃腸道、肝功能、腎功能等不良反應，很多患者無法長期堅持，治療效果不佳[2]。因此，開發新型、有效、低毒和適合長期服用的RA藥物，已經成為研究熱點。

RA屬中醫學“痹證”范疇。中藥在治療RA方面有悠久的歷史，也取得較好的效果[3]。白芍為毛茛科植物芍藥的根，具有養血斂陰、柔肝止痛和平抑肝陽之效，可治療疼痛病證[4]?，F代研究表明，白芍總苷具有抗炎、鎮痛和免疫調節等作用，已經用于RA的臨床治療，且未見明顯的不良反

應[5-6]。而且，古代文獻記載了白芍是治療“痹證”的常用中藥[7]。但是，白芍治療RA具體的藥效物質基礎及作用機制未見報道。因此，本文借助網絡藥理學技術[8]，從分子層面研究白芍化合物與RA相關通路重要靶點的相互作用，為其后續的藥物開發和實驗提供依據。

1 材料與設備

1.1 實驗材料 白芍分子數據集，RA靶蛋白數據集。

1.2 實驗設備 本實驗采用Accelrys公司的Discovery Studio（DS）軟件進行計算，其運行環境是：DS2.0圖形工作站和Microsoft Windows XP Professional，SP2操作系統。計算模擬過程中所用的參數除非特別指明，否則均為缺省值。

2 方 法

2.1 分子數據集建立 從北京大學天然產物庫中下載白芍的化學成分[9]，共計79個。在DS軟件中，保存為sd文件，建立白芍分子數據集。根據治療靶數據庫（TTD）[10]和文獻[11-12]，確定與RA相關p38 MAPK、JNK和PI3K-AKT信號通路中的關鍵蛋白p38、JNK和PI3K為研究靶點。在RCSB Protein Data Bank上[13]，下載其蛋白質-配體復合物晶體結構。

2.2 分子對接 白芍分子集配體與RA治療靶點在DS軟件的LigandFit模塊中進行分子對接[8，14]。具體如下：蛋白結構去溶劑、去配體、加氫處理后，以其所含的活性原配體來確定活性位點；在“Input Ligands”中輸入白芍sd文件。使用蒙特卡羅方法對白芍配體進行構象采樣、Dreiding力場下進行打分，保留得分最高的構象。對對接成功配體化合物的DOCK-SCORE進行排序[15]，尋找比原配體DOCK-SCORE高的化合物，視為白芍治療RA的藥效物質基礎[16]。

2.3 生物網絡構建 將RA藥效物質基礎與靶點當作節點，相互作用用邊表示。采用Cytoscape軟件構建白芍化合物-靶點作用網絡[17]；在此基礎上，若靶點為通路中的蛋白，化合物為該靶點作用的化合物，化合物和通路也當作節點，相互作用用邊表示，由此構建白芍化合物-通路作用網絡[18]。通過Cytoscape軟件中Plugins面板下Network Analysis分析白芍中化合物與靶點、化合物與通路的作用情況。

3 結 果

3.1 白芍治療RA的分子對接 本實驗以p38、JNK-1、JNK-3、PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ為虛擬藥理篩選模型，以蛋白的原配體DOCK-SCORE值為閾值，從白芍中篩選出潛在的活性化合物數目分別為10，2，3，7，19和7，共計25個，見表2。其中，UNPD191674、UNPD167613、UNPD144202、UNPD143034、UNPD13820、UNPD135747、

UNPD117238和UNPD101079屬于苷類化合物，

UNPD99008、UNPD92271、UNPD214940、UNPD212849、UNPD210702和UNPD186304屬于有機酸類化合物，UNPD6788、UNPD93947、UNPD86328、UNPD71815、UNPD58764、UNPD53453、UNPD170165、UNPD169525、UNPD153434和UNPD141059屬于多酚類化合物，UNPD195730屬于黃酮類化合物。提示白芍有效成分群為苷類、有機酸、多酚類和黃酮類化合物。

3.2 白芍治療RA的生物網絡 依據分子對接的白芍化合物及其所作用的靶點，構建了白芍化合物-靶點作用網絡，該網絡中含有31個節點（包括6個靶蛋白節點和25個化合物節點）以及41條邊，見圖1。52%的化合物能作用于1個靶點，僅有28%的化合物能作用≥3個靶點，見圖2。依據化合物、靶點及其通路的關系，構建了白芍的化合物-通路作用網絡，該網絡中含有28個節點（包括3個信號通路節點和25個化合物節點）以及37條邊，見圖3。通過Network Analysis分析兩個網絡中重要節點的網絡特征，見表3和表4。表3的“度”代表化合物節點作用的靶點數，結果顯示，化合物節點UNPD58764能作用的最大靶點數達到5個。表4中“度”代表化合物節點作用的通路數或通路節點能作用的化合物數，結果顯示，PI3K-AKT信號通路節點能作用的化合物最大數目達到24個，化合物節點UNPD143034、UNPD53453、UNPD144202和UNPD167613能作用的通路數目最大可達到3。上述直觀顯示了白芍的多成分、多靶點和多通路

作用。

4 討 論

目前，已經明確RA的各種致病因子所作用的“靶組織”為滑膜關節[19]。在RA的滑膜組織中，p38呈現高表達并被激活，且p38抑制劑可以抑制炎癥和骨破壞，并能減少細胞中促炎癥細胞因子的產生[11，20]。Mun等[21]研究發現，JNK抑制劑可下調體外培養的膠原誘導性大鼠成纖維滑膜細胞中基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和MMP-3的表達，來減輕關節和軟骨破壞。Yang等[22]研究也發現，JNK抑制劑雷公藤甲素能抑制RA成纖維細胞樣滑膜細胞的遷移。此外，Harris等[23-24]研究發現，PI3K-AKT信號通路在RA滑膜細胞中廣泛存在，并處于異常激活狀態，是造成滑膜細胞凋亡失衡的原因之一。研究發現，PI3K抑制劑ZSTK474具有抗RA作用，能明顯改善膠原誘導的小鼠關節炎癥狀，且副作用小[25]。因此，p38、JNK和PI3K已經成為治療RA的重要靶點和研究對象。

鑒于RA的發病機制復雜，單一靶點的藥物難以有較好的療效，多靶點的聯合藥物治療已經成為未來治療RA的趨勢[26]。國內外學者將中藥視為組合化合物庫，且因其具有多靶點作用，是國內外發現RA藥物的重要來源[27-28]。但是，由于中藥成分復雜，若按傳統的提取分離到活性測定，時間長、難度大，特別是有些化合物含量很低，提取分離很難，活性也難以檢測，影響到中藥開發。在此背景下，前期筆者課題組提出了從“活性成分到中藥”的反向途徑出發，將基于分子對接的網絡藥理學成功用于雷公藤治療RA的藥效物質基礎及其機制研究中，從整體水平反映了雷公藤治療RA的特點[29]。此外，柯志鵬等[30]運用網絡藥理學研究了芪桂痛風片的藥效物質基礎與分子作用機制，高耀等[31]基于網絡藥理學研究了逍遙散抗抑郁活性成分作用靶點，張新莊等[32]利用網絡藥理學方法研究了熱毒寧注射液抗流感病毒的分子作用機制，蘇真真等[33]基于網絡藥理學方法探討了銀黃口服液抗呼吸道感染的作用機制。因此，網絡藥理學已經成為中藥研究領域最常見的技術之一。

本實驗以p38 MAPK、JNK和PI3K-AKT信號通路中的關鍵蛋白p38、JNK和PI3K為靶點，利用分子對接研究白芍化合物與靶點的相互作用，構建了白芍化合物-靶點作用網絡及化合物-通路作用網絡。圖1和圖3顯示了大多數化合物只能作用于1個靶點或1條通路，只有少數化合物可作用于多個靶點或多條通路。圖2顯示具有混雜藥物和組合藥物性質的化合物個數分別為12和13，提示在治療RA上白芍可能擁有更多類似組合藥物的化合物。為了進一步評價網絡中節點的重要性[30]，筆者分析了節點的度和介數，見表3和表4。在化合物-靶點作用網絡模型中，表3顯示白芍治療RA的藥效物質基礎中重要化合物為多酚類（UNPD58764、UNPD141059、UNPD53453、UNPD170165、UNPD86328、UNPD71815和UNPD153434）和苷類（UNPD143034、

UNPD144202和UNPD195730）。提示白芍中這兩

類成分可以作為未來開發的重點。其中，已有實驗報道，tannic acid（UNPD58764）能作用p38 MAPK信號轉導通路[34]，這與本文研究UNPD58764能與p38相互作用相符合。在化合物-通路作用網絡模型中，表4顯示白芍中化合物能作用于p38 MAPK、JNK和PI3K-AKT信號通路，提示白芍可能通過抑制這3條通路的活化，抑制炎癥和骨破壞，從而達到治療RA的作用。其中，實驗已經證實了白芍能作用于p38 MAPK、JNK信號通路，達到對大鼠膠原性關節炎的治療作用，為白芍治療RA提供依據[35]。而且，PI3K-AKT信號通路具有較高的度和介數值，是網絡中一個重要節點，是未來開展白芍治療RA作用機制的重點研究對象。

總之，網絡藥理學直觀展示了白芍治療RA的多成分、多靶點和多通路作用，為后續白芍藥效物質基礎及分子作用機制實驗研究提供導向作用，也為從白芍中進行RA新藥開發提供依據。在此基礎上，未來將收集更多的RA通路和蛋白，把白芍化合物、靶點、通路、疾病和證候關聯在一起，開展白芍的多尺度網絡藥理學研究，從分子水平揭示白芍的適應證以及對其功效進行現代語言學闡釋。

5 參考文獻

[1] 劉獻祥，林燕萍.中西醫結合骨傷科學[M].北京：科學出版社，2011：239-242.

[2] 梁燕，鄒豪.類風濕性關節炎藥物治療研究進展[J].海軍醫學雜志，2014，35（4）：332-333.

[3] 陳曉俊，王健英，金素安，等.中藥影響類風濕性關節炎信號通路的研究進展[J].中華中醫藥學刊，2016，34（7）：1735-1739.

[4] 高學敏.中藥學[M].北京：中國中醫藥出版社，2002：541-542.

[5] 祝玉慧.白芍治療類風濕性關節炎的臨床及實驗研究進展[J].實用醫藥雜志，2005，22（1）：75-76.

[6] 李俊，李延鳳，周愛武，等.白芍總甙的毒性研究[J].中國藥理學通報，1991，7（1）：53-55.

[7] 李兵，符永馳，張偉娜.白芍治療類風濕性關節炎配伍應用古代文獻分析[J].遼寧中醫藥大學學報，2014，16（1）：132-133.

[8] Zheng C，Qiu M，Xu X，et al.Understanding the diverse functions of Huatan Tongluo Fang on rheumatoid arthritis from a pharmacological perspective[J].Exp Ther Med，2016，12（1）：87-94.

[9] Gu J，Gui Y，Chen L，et al.Use of natural products as chemical library for drug discovery and network pharmacology[J].PLoS One，2013，8（4）：e62839.

[10] Zhu F，Shi Z，Qin C，et al.Therapeutic target database update 2012：a resource for facilitating target-oriented drug discovery[J].Nucleic Acids Res，2012，40（Database issue）：D1128-D1136.

[11] 張彥景，張建新.MAPK信號轉導通路與類風濕關節炎的研究進展[J].河北醫藥，2016，38（17）：2677-2681.

[12] 于靜雅，陳勇.PI3K-AKT信號通路及其在類風濕性關節炎滑膜細胞增殖和凋亡中的作用[J].細胞與分子免疫學雜志，2014，30（12）：1326-1329.

[13] Deshpande N，Addess KJ，Bluhm WF，et al.The RCSB Protein Data Bank：a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema[J].

Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：D233-D237.

[14] Montes M，Braud E，Miteva MA，et al.Receptor-based viral ligand screening for the identification of novel CDC25 phosphatase inhibitors[J].J Chem Inf Model，2008，48（1）：157-165.

[15] 鄭春松，徐筱杰，葉蕻芝，等.兩種治法方藥治療骨性關節炎的計算機模擬比較研究[J].中國中西醫結合雜志，2014，34（4）：480-485.

[16] 鄭春松，徐筱杰，葉蕻芝，等.青風藤治療骨性關節炎藥效物質基礎多靶導向作用的計算機模擬研

究[J].中國中西醫結合雜志，2012，32（3）：375-379.

[17] Smoot ME，Ono K，Ruscheinski J，et al.Cytoscape 2.8：

new features for data integration and network visualization[J].Bioinformatics，2011，27（3）：431-432.

[18] Luo F，Gu J，Zhang X，et al.Multiscale Modeling of Drug-induced Effects of ReDuNing Injection on Human Disease：From Drug Molecules to Clinical Symptoms of Disease[J].Sci Rep，2015，5：10064.

[19] Mor A，Abramson SB，Pillinger MH.The fibroblast-like synovial cell in rheumatoid arthritis：a key player in inflammation and joint destruction[J].Clin Immunol，2005，115（2）：118-128.

[20] Choo QY，Ho PC，Tanaka Y，et al.The histone deacetylase inhibitors MS-275 and SAHA suppress the p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway and chemotaxis in rheumatoid arthritic synovial fibroblastic E11 cells[J].Molecules，2013，18（11）：14085-14095.

[21] Mun SH，Kim HS，Kim JW，et al.Oral administration of curcumin suppresses production of matrix metalloproteinase（MMP）-1 and MMP-3 to ameliorate collagen-induced arthritis：inhibition of the PKCdelta/JNK/c-Jun pathway[J].J Pharmacol Sci，2009，111（1）：13-21.

[22] Yang Y，Ye Y，Qiu Q，et al.Triptolide inhibits the migration and invasion of rheumatoid fibroblast-like synoviocytes by blocking the activation of the JNK MAPK pathway[J].Int Immunopharmacol，2016，41：8-16.

[23] Harris SJ，Foster JG，Ward SG.PI3K isoforms as drug targets in inflammatory diseases：lessons from pharmacological and genetic strategies[J].Curr Opin Investig Drugs，2009，10（11）：1151-1162.

[24] Smith MD，Weedon H，Papangelis V，et al.Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane：modulation by disease-modifying anti-rheumaticdrug treatment[J].Rheumatology（Oxford），2010，49（5）：862-875.

[25] Tamura N.Recent findings on phosphoinositide-3 kinase in rheumatic diseases[J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi，2012，35（1）：8-13.

[26] Haraoui B.Assessment and management of rheumatoid arthritis[J].J Rheumatol，2009，36（8）：1851.

[27] Ehrman TM，Barlow DJ，Hylands PJ.In silico search for multi-target anti-inflammatories in Chinese herbs and formulas[J].Bioorg Med Chem，2010，18（6）：2204-2218.

[28] Lü S，Wang Q，Li G，et al.The treatment of rheumatoid arthritis using Chinese medicinal plants：From pharmacology to potential molecular mechanisms[J].J Ethnopharmacol，2015，176：177-206.

[29] 嚴培晶，鄭春松，葉蕻芝，等.基于計算機模擬研究雷公藤治療類風濕關節炎的藥效物質與分子作用機制[J].中國組織工程研究，2016，20（12）：1818-1824.

[30] 柯志鵬，張新莊，丁玥，等.利用網絡藥理學方法研究芪桂痛風片的藥效物質基礎與分子作用機制[J].中國中藥雜志，2015，40（14）：2837-2842.

[31] 高耀，高麗，高曉霞，等.基于網絡藥理學的逍遙散抗抑郁活性成分作用靶點研究[J].藥學學報，2015，50（12）：1589-1595.

[32] 張新莊，蕭偉，徐筱杰，等.利用網絡藥理學方法研究熱毒寧注射液抗流感病毒的分子作用機制[J].物理化學學報，2013，29（7）：1415-1420.

[33] 蘇真真，李娜，曹亮，等.基于網絡藥理學方法探討銀黃口服液抗呼吸道感染的作用機制[J].計算機與應用化學，2016，33（9）：971-975.

[34] Pietsch K，Saul N，Swain SC，et al.Meta-Analysis of Global Transcriptomics Suggests that Conserved Genetic Pathways are Responsible for Quercetin and Tannic Acid Mediated Longevity in C.elegans[J].Front Genet，2012，3：48.

[35] 賈曉益，常艷，張磊，等.白芍總苷對膠原性關節炎滑膜組織MAPKs信號通路的調控作用[J].安徽醫科大學學報，2013，48（9）：1067-1070.

收稿日期：2016-12-26；修回日期：2017-02-23