芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的網絡藥理學研究與實驗驗證

鄒陶媛 寧云紅 郭承偉

摘要 目的：通過網絡藥理學預測芍藥甘草湯主要活性成分治療葡萄膜炎的作用機制，并選擇T細胞受體信號通路所介導T細胞轉化后的效應分子γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-10進行驗證。方法：檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機制生物信息學分析工具庫（BATMAN-TCM），篩選芍藥甘草湯成分、靶點和葡萄膜炎靶點。使用Cytoscape 3.7.2軟件構建成分靶點網絡、成分疾病靶點網絡、靶點相互作用網絡。拓撲分析篩選關鍵靶點后使用軟件插件ClueGO進行基因本體（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）分析。采用光感受器間維生素A類結合蛋白混合完全弗氏佐劑及結核桿菌皮下注射復制實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，HE染色檢測視網膜炎癥變化，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清IFN-γ、IL-10含量。結果：芍藥甘草湯中47種候選成分（白芍35種、炙甘草12種），涉及治療葡萄膜炎作用靶點164個，拓撲分析關鍵靶點33個。富集分析結果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與細胞對活性氧的反應、多種細胞增殖與分化、一氧化氮與神經遞質等分子的代謝調節、IL-6的細胞反應等生物過程有關，涉及IL-17信號通路、TNF信號途徑、Th17細胞分化、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等。芍藥甘草湯可緩解大鼠視網膜炎癥，降低炎癥評分（P<0.01），減少IFN-γ和增加IL-10的含量（均P<0.01）。結論：芍藥甘草湯治療葡萄膜炎過程涉及多個重要炎癥與免疫通路，這將成為研究其作用機制的重要參考。

關鍵詞 芍藥甘草湯;葡萄膜炎;網絡藥理學;炎癥;免疫;實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型;γ干擾素;白細胞介素-10

Mechanism of Shaoyao Gancao Decoction against Uveitis：Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

ZOU Taoyuan1，NING Yunhong2，GUO Chengwei1，2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250011，China）

Abstract Objective：This study predicted the targets of the active compounds of Shaoyao Gancao Decoction（SGD） through network pharmacology，to explore the mechanism of SGD against uveitis.Moreover，the effectors interferon（IFN）-γ and interleukin（IL）-10 after T cell receptor signaling pathway-mediated T cell transformation were selected for the verification.Methods：The components and targets of SGD and the targets of uveitis were searched from databases.The component-target network，component-disease target network，and protein-protein interaction network were constructed with Cytoscape 3.7.2.The key targets were screened by topological analysis，followed by Gene Ontology（GO） term and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment of the targets with Cytoscape 3.7.2 plug-in ClueGO.Autoimmune uveitis was induced in rats through subcutaneous injection of the mixture of inter-photoreceptor retinoid-binding protein and complete Freund′s adjuvant，and tubercle bacillus.The changes of retinal inflammation were detected based on hematoxylin and eosin（HE） staining and the content of IFN-γ and IL-10 in serum was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：A total of 47 candidate components（35 from Radix Paeoniae Alba and 12 from Radix Glycyrrhizae Preparata） of SGD，164 targets against uveitis，and 33 key targets were screened out.The key targets were mainly involved in the biological processes such as cell response to reactive oxygen species，proliferation and differentiation of various cells，metabolic regulation of nitric oxide and neurotransmitters，and cellular response of IL-6，and the pathways of IL-17 signaling pathway，tumor necrosis factor（TNF） signaling pathway，Th17 cell differentiation，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway，etc.SGD can relieve retina inflammation，decrease inflammation score（P<0.01），lower IFN-γ level，and raise IL-10 content（Ps<0.01），which validated part of the prediction results of network pharmacology.Conclusion：SGD exerts therapeutic effect on uveitis through multiple important immune and inflammatory pathways，which can serve as a reference for exploring the mechanism.641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

Keywords Network pharmacology; Shaoyao Gancao Decoction; Uveitis; Inflammation; Immune; Experimental autoimmune uveitis; IFN-γ; IL-10

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.005

葡萄膜炎是眼科常見疾病，也是主要致盲眼病之一。研究表明，各種類型葡萄膜炎的總體致盲率高達18.76%，其中白塞綜合征的致盲率甚至超過30.00%，與青光眼致盲率相近[1]。葡萄膜炎以青壯年患者為主，導致患者過早喪失勞動能力[2]。研究表明，自身免疫反應是除感染因素外導致葡萄膜炎發生的最重要原因[3]。中醫中藥在葡萄膜炎的治療和后期康復的過程中被廣泛應用，可以通過調節人體免疫功能以達到抗炎的作用，并取得良好成效[1]。

葡萄膜炎中醫稱為“瞳神緊小”病，是瞳神持續性縮小，展縮失靈的病理狀態。芍藥甘草湯最早見于《傷寒論》，為柔肝緩急的代表方劑，主治筋脈痙攣疼痛。本課題組前期研究發現，該病的潛在病因與肝失濡養，陰虛而致虛火上炎有關[4]，故以芍藥甘草湯治療葡萄膜炎，病證相合。同時，課題組也開展相應臨床試驗，結果顯示芍藥甘草湯治療葡萄膜炎效果顯著，可提高患者視力，降低中醫證候積分[5]。

鑒于芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的機制尚未充分闡明，故選擇網絡藥理學的研究方法，篩選芍藥甘草湯的主要活性化學成分及作用靶點，收集葡萄膜炎已知的疾病靶點，根據網絡拓撲分析及Cytoscape 3.7.2軟件ClueGO插件富集分析結果，挖掘芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的多成分、多靶點作用機制，并通過復制實驗性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis，EAU）大鼠模型，使用芍藥甘草湯治療后驗證相關結果，為芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的炎癥機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

5～8周齡SD大鼠，雄性，30只，體質量為（180±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[動物許可證號：SCXK（魯）20130009]。行常規檢查，排除眼部疾患后于山東中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心屏障環境設施適應性飼養1周，光照交替12 h環境，自由獲得飲水及飼料。

1.1.2 藥物

白芍、炙甘草由山東中醫藥大學附屬醫院提供。

1.1.3 試劑與儀器

完全弗氏佐劑（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）（sigma公司，美國，貨號：F5881）;光感受器間維生素A類結合蛋白（Interphotoreceptor Retinoid-binding Protein，IRBP）（上海生工生物有限公司，批號：P21622）;結核分枝桿菌H37RA（BD Difco公司，美國，貨號：M4537）;γ干擾素（Interferon，IFN-γ）、白細胞介素（Interleukin，IL）-10 ELISA Kit（eBioscience公司，美國，貨號：BMS621、BMS629）;蘇木精-伊紅（HE，天津市北連精細化學有限公司，批號：20160801）。

光學顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：BX51-DP20）;冷凍離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5424R）;Multiskan GO酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司，美國，型號：1510）。

1.2 方法

1.2.1 芍藥甘草湯所含主要化學成分的收集與篩選

本研究使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）[6]，中藥分子機制生物信息學分析工具庫（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsd.org/batman-tcm）[7]，以“白芍”“炙甘草”為關鍵詞檢索2味中藥的主要化學成分。其中，TCMSP數據庫選擇化合物的篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN-TCM數據庫設置相似性模型閾值Score cutoff≥20，P≤0.05[8]。另外，結合芍藥甘草湯相關化學成分的文獻數據，以主要化學成分具有生物活性和藥理作用為標準，補充上述數據庫的不足。最后，使用有機小分子生物活性數據庫（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[9]對主要化學成分進行查詢，獲取化合物SMILES等信息，建立“中藥-化學成分”數據集。

1.2.2 化學成分潛在靶點的收集與篩選

使用TCMSP數據庫、BATMAN-TCM數據庫收集芍藥甘草湯候選化學成分的同時，記錄數據庫收錄的潛在靶點。另外使用Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）[10]檢索，以配體預測方法預測相關化合物的潛在靶點。對所收集靶點使用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）[11]剔除非人源靶點，并校正所有蛋白名稱為官方名稱，建立“中藥-化學成分-靶點”數據集，使用Cytoscape 3.7.2構建“中藥-化學成分-靶點”網絡圖。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

1.2.3 葡萄膜炎的疾病靶點收集與篩選

本研究使用治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd）[12]、DRUGBANK數據庫（https：//www.drugbank.ca）[13]、DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org/home/）[14]、比較毒物遺傳學數據庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org）[15]、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）[16]、在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.omim.org）[17]、GAD數據庫（https：//geneticassociationdb.nih.gov）[18]，以“uveitis”為關鍵詞檢索，收集相關的靶點基因，并通過Uniprot數據庫校正，去除重復項，建立“疾病-靶點”數據集。

1.2.4 “中藥-化學成分-靶點”和“疾病-靶點”交集網絡構建與關鍵靶點篩選

將所得“中藥-化學成分-靶點”數據集與“疾病-靶點”數據集進行韋恩分析，建立“中藥-化學成分-靶點-疾病”數據集，構建數據網絡，初步挖掘芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的作用靶點。

將“中藥-化學成分-靶點-疾病”數據集中靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/）[19]，限定物種為“Homo sapiens”，構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡。通過Cytoscape 3.7.2軟件插件CytoNCA[20]對所得PPI網絡進行拓撲分析，分析內容包括中心性（Degree Centrality，DC）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC），并計算相應的中位數值。關鍵靶點為DC值大于2倍DC中位數值，且BC、EC、CC指標大于所有節點中位數的節點。

1.2.5 富集分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件插件ClueGO[21]進行芍藥甘草湯活性成分治療葡萄膜炎關鍵靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注釋富集分析。富集分析內容包括生物過程和信號通路，分析芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能的作用機制。計算富集結果的每個P值，以P<0.05為篩選條件，P<0.01被認為是顯著富集，獲得顯著富集的生物學過程和信號通路。

1.2.6 溶液制備

稱取白芍400 g、炙甘草400 g，浸泡30 min，煎煮2次，一煎加5.5倍量的水，二煎加4倍量水，過濾，合并水煎液，減壓濃縮得到芍藥甘草湯水提液800 mL，濃度為1 g/mL（按生藥量計算），備用。大鼠臨床等效劑量為1.2 g/100 g，則芍藥甘草湯水提液按1.2 mL/100 g灌胃給藥，1次/d，連續14 d。

1.2.7 實驗分組與造模

30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、芍藥甘草湯組，每組10只。實驗采用大鼠皮下注射IRBP的方法建立EAU動物模型。于超凈臺內配制含IRBP的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered Saline，PBS）0.6 mL，與結核分枝桿菌H37RA粉劑10 mg，PBS 1.4 mL，CFA 2 mL，充分混合，得乳劑4 mL。分別自大鼠足墊中部皮下進針，向上潛行至腔骨上端皮下處，每側緩慢推注混合乳劑0.1 mL。

1.2.8 HE檢測大鼠視網膜病理變化

灌胃2周后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，處死動物摘取眼球后，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜。石蠟包埋，經瞳孔視乳頭軸作矢狀切面切片（4 μm）。對組織切片進行HE染色，光學顯微鏡下觀察形態學改變及炎癥細胞浸潤情況，依據Caspi眼部組織病理評分標準進行病理學評級[22]。

1.2.9 ELISA檢測大鼠血清IFN-γ及IL-10的含量

大鼠灌胃2周后收集心臟血，4 ℃離心（3 000×g，15 min）后取上清，采用ELISA測定血清中IFN-γ、IL-10含量。依據說明書進行操作，酶標儀在450 nm下測定吸光度，計算各組大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量。

1.3 統計學方法

實驗數據統一用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芍藥甘草湯的“中藥-化學成分”數據集

對白芍與炙甘草進行化學成分檢索后篩選，刪除重復項，記錄SMILES信息[Paeoniflorin_qt（芍藥苷元）在PubChem中未檢索到]，共得到化合物44個，包括白芍35個和炙甘草9個。而文獻檢索結果顯示，甘草中甘草苷、甘草素與甘草查爾酮A在炮制后含量明顯升高，且具有明顯的抗炎、抗腫瘤等活性[23]。見表1。

2.2 芍藥甘草湯的“中藥-化學成分-靶點”網絡

通過TCMSP數據庫、BATMAN-TCM數據庫與Swiss Target Prediction數據庫獲得芍藥甘草湯候選化學成分的潛在靶點，通過Uniprot數據庫校正，獲得白芍候選成分治療靶點600個，炙甘草323個，刪除重復項后獲得芍藥甘草湯候選成分潛在靶點712個?！爸兴?化學成分-靶點”網絡由761個節點和1 975個邊組成。見圖1。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

2.3 葡萄膜炎的“疾病-靶點”數據集

使用TTD數據庫、DRUGBANK數據庫、DisGeNET數據庫、CTD數據庫、GeneCards數據庫、OMIM數據庫、GAD數據庫，分別收集葡萄膜炎相關靶點基因2、160、10、25、994、12、18個，校正刪除重復項后獲得靶點995個。

2.4 “中藥-化學成分-靶點-疾病”數據集與關鍵靶點篩選

將“中藥-化學成分-靶點”數據集與“疾病-靶點”數據集中靶點進行韋恩分析，建立“中藥-化學成分-靶點-疾病”數據集，構建數據網絡。見圖2。獲得芍藥甘草湯27個候選治療葡萄膜炎的潛在靶點基因164個，該網絡由193個節點和468個邊組成。見圖2。

將芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的潛在靶點基因導入STRING數據庫，限定物種為“Homo sapiens”，獲得PPI網絡由163個點，2 164個邊組成。使用CytoNCA對PPI網絡進行拓撲分析，計算網絡節點DC中位數為20、BC中位數為51.619 110、EC中位數為0.045 793、CC中位數為0.490 909。根據網絡藥理學篩選方法，選擇DC>40并綜合BC>51.619 110、EC>0.045 793、CC>0.490 909的節點，得到33個關鍵靶點，同時獲得芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的關鍵靶點PPI圖。見表2，圖3。

2.5 富集分析

GO富集分析結果涉及95個生物過程（P<0.05），主要包括細胞對活性氧的反應、多種細胞的增殖與分化、一氧化氮與神經遞質等分子的代謝調節、IL-6的細胞反應等（P<0.01）。見圖4（前20位）。KEGG信號通路富集分析的結果涉及117個信號通路（P<0.05），主要包括TNF信號途徑、IL-17信號通路、Th17細胞的分化、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等（P<0.01），同時，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、前列腺癌、弓形蟲病等也被顯著富集。見圖5（前20位）。

2.6 芍藥甘草湯對EAU大鼠視網膜病理的影響

HE染色結果顯示，與對照組比較，模型組視網膜各層結構排列明顯紊亂、迂曲，內、外核層細胞大小較一致，部分細胞空泡變性;叢內神經節細胞層、內網狀層及內核狀層、外核層出現炎癥細胞浸潤。經芍藥甘草湯治療后，視網膜各層結構表現為輕度迂曲;神經節細胞層、內網狀層及內核狀層出現少量炎癥細胞浸潤。見圖6。相應炎癥評分顯示，模型組大鼠炎癥評分高于對照組，而芍藥甘草湯治療后炎癥評分顯著下降（P<0.01）。見表3。

2.7 芍藥甘草湯對EAU大鼠血清IFN-γ、IL-10的影響

ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量升高（P<0.01），與已報道EAU動物模型的表達趨勢一致[24]。經芍藥甘草湯治療后，大鼠血清中炎癥介質IFN-γ含量顯著下降（P<0.01），抗炎因子IL-10含量進一步升高（P<0.01）。見圖7。

3 討論

目前，我國治療葡萄膜炎的藥物主要是散瞳劑和睫狀肌麻痹劑、糖皮質激素、非甾體抗炎藥和免疫抑制劑等[25]。但臨床應用時存在有藥物不良反應、患者依從性較差等局限性，不同程度上影響疾病的治療。

本研究利用網絡藥理學討論芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的理論機制。結果顯示，芍藥甘草湯中47種候選成分，包括芍藥35種和炙甘草12種，涉及治療葡萄膜炎的作用靶點164個，經拓撲分析后獲得關鍵靶點33個。富集分析研究結果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與細胞對活性氧的反應、多種細胞的增殖與分化、一氧化氮與神經遞質等分子的代謝調節、IL-6的細胞反應等生物過程有關，涉及到IL-17信號通路、TNF信號途徑、Th17細胞的分化、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等。KEGG結果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與IL-17信號通路、Th17細胞的分化有關。研究顯示，葡萄膜炎患者活動期Th17細胞比例及相關細胞因子水平升高，而Treg細胞出現相應水平下降[26]。本課題組前期已通過實驗研究發現，在實驗性免疫性葡萄膜炎大鼠模型中，芍藥甘草湯能夠下調IL-17表達而減大鼠眼部炎性病變[4]，這證實了本研究預測結果的準確性。

本研究還預測芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可通過影響T細胞信號受體通路實現。研究表明，初始CD4+T細胞在T細胞受體介導下活化，可分化為Th1、Th2、Th17和Treg細胞而參與不同類型的免疫應答。葡萄膜炎被認為是由CD4+T細胞介導的自身免疫性疾病，主要侵犯視網膜和葡萄膜[27]。在EAU模型中，引起趨化單核細胞聚集至眼的IFN-γ增加[28]，IFN-γ是一種炎癥介質;而抗炎因子IL-10可通過抑制T細胞、單核細胞或巨噬細胞的活化等對抗EAU[29-30]。本研究通過復制EAU大鼠模型，使用芍藥甘草湯治療后發現，EAU大鼠視網膜炎癥反應明顯下降，可能與IFN-γ的減少和IL-10的增加有關，實驗結果進一步證明網絡藥理學的準確性。此外，Mizuki等[31]通過體內實驗發現，EAU的發病期外周血液中TNF-α水平急劇上升，在緩解期外周血液中TNF-α水平有所下降。給實驗動物皮下注射TNF-α后，可使EAU的發病率與相關病情顯著增加[32]。而本研究結果預測，芍藥甘草湯可能通過干預TNF信號途徑治療葡萄膜炎，這可成為未來進一步的實驗研究方向的基礎。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法預測了芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的主要機制，涉及多種有效成分、靶點和通路，并在課題組已有的臨床與實驗結果基礎上，進一步檢測芍藥甘草湯對EAU的IFN-γ、IL-10的影響。為研究芍藥甘草湯活性成分的作用靶點和作用機制提供思路和依據，也為該方的臨床應用與藥物開發提供參考。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

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（2021-03-24收稿 本文編輯：張樂杰）

基金項目：山東省中醫藥科技發展計劃項目（2019-0086）作者簡介：鄒陶媛（1995.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：眼底病與炎癥性眼病的研究，E-mail：940032160@qq.com通信作者：郭承偉（1964.11—），男，博士，教授，主任醫師，研究方向：眼底病的理論與臨床研究，E-mail：guocw12009@163.com641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0