基于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體探討天麻鉤藤顆粒對肝陽上亢證腎損害的作用機制

孫治琪 劉晨笑 孟玥 趙永烈 劉子旺

摘要 目的：通過對大鼠血壓、血清炎癥介質及腎臟病理學切片的檢測，探討天麻鉤藤顆粒對高血壓大鼠肝陽上亢證腎損害的改善作用及機制。方法：取32只自發性高血壓大鼠（SHRs），隨機分為對照組、模型組、天麻鉤藤顆粒組（中藥組）、尼莫地平組（西藥組），每組8只，其中模型組、中藥組、西藥組給予附子湯灌服進行肝陽上亢證造模，再分別給予蒸餾水、天麻鉤藤顆粒、尼莫地平灌服14 d。6只正常SD大鼠作為空白組，空白組、對照組給予蒸餾水灌服42 d。干預前后分別測量血壓，干預后進行血清炎癥介質核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶（Caspase）-1及腎臟病理學切片檢測。結果：西藥組干預后收縮壓明顯降低（P<0.05），余干預前后變化不明顯（P>0.05）;與正常組比較，對照組、模型組、中藥組大鼠血清中NLRP3、ASC、Caspase-1水平均升高，中藥組較對照組、模型組較低（P<0.05）;與空白組比較，對照組、模型組、中藥組、西藥組均出現腎小球缺血性表現，腎小球固縮，部分腎小球纖維化和玻璃樣變，腎小管萎縮、消失，其中中藥組、西藥組較對照組、模型組2組病變有所減輕。結論：天麻鉤藤顆粒對自發性高血壓大鼠肝陽上亢證腎損害具有改善作用，其作用機制可能與抑制NLRP3炎癥小體合成有關。

關鍵詞 自發性高血壓大鼠;肝陽上亢證;腎損害;核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體;天麻鉤藤顆粒;平肝潛陽;作用機制

Mechanism of Tianma Gouteng Granules against Kidney Damage in SHRs with Ascendant Hyperactivity of Liver Yang：Based on NLRP3 Inflammasome

SUN Zhiqi，LIU Chenxiao，MENG Yue，ZHAO Yonglie，LIU Ziwang

（Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：This study aims to investigate the mechanism of Tianma Gouteng Granules against renal damage in hypertension rats with the pattern of ascendant hyperactivity of liver yang based on blood pressure，serum inflammatory factors，and kidney pathological sections.Methods：A total of 32 spontaneously hypertensive rats（SHRs） were randomized into control group，model group，Tianma Gouteng Granules group（Chinese medicine group），and nimodipine group（western medicine group），8 in each group.Fuzi Decoction was used（i.g.） to induce the pattern of ascendant hyperactivity of liver yang in the model group，Chinese medicine group，and western medicine group，respectively，and then they were separately treated with distilled water，Tianma Gouteng Granules，and nimodipine for 14 days.Six normal SD rats were treated as blank group，and the blank group and control group were given（i.g.） distilled water for 42 days.Blood pressure was measured before and after intervention.Serum inflammatory factors nucleotide-binding domain-like receptor protein3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein containing CARD（ASC），and caspase-1 were detected and renal pathological sections were observed after intervention.Results：The systolic blood pressure was reduced in the western medicine group after intervention（P<0.05），and the variation in blood pressure after intervention was not significant in other groups（P>0.05）.The serum levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in the control group，model group，and Chinese medicine group were higher than those in the blank group，and the levels in the Chinese medicine group were lower than those in the control group and the model group（P<0.05）.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

pared with the blank group，the control group，model group，Chinese medicine group，and western medicine group all showed glomerular ischemic manifestations，glomerular shrinkage，partial glomerular fibrosis and hyaline degeneration，and tubular atrophy and disappearance，and these pathological changes were milder in the Chinese medicine and western medicine groups than in the control and model groups.Conclusion：Tianma Gouteng Granules can relieve the kidney damage in SHRs with ascendant hyperactivity of liver yang possibly by inhibiting the synthesis of NLRP3 inflammasome.

Keywords Spontaneously hypertensive rats; Syndrome of ascendant hyperactivity of liver yang; Renal damage; NLRP3 inflammasome; Tianma Gouteng Granules; Pacifying liver and subduing yang; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.007

高血壓是心血管疾病中發病率最高的疾病之一，持續性的高血壓可損傷重要臟器，如心、腦、腎的結構和功能，最終導致器官衰竭[1]。研究發現，高血壓是引起腎臟損害和終末期腎病的重要危險因素[2]。高血壓腎損害在中醫古籍中無明確記載，屬“眩暈”“癃閉”“水腫”等范疇[3]。其中，肝陽上亢型高血壓更容易引起腎臟疾病發生[4]。本實驗中用附子湯灌胃自發性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHRs）進行肝陽上亢證造模，天麻鉤藤顆粒進行治療干預，通過對血壓、相關血清學指標及腎臟病理學切片的檢測，旨在探討天麻鉤藤顆粒對自發性高血壓肝陽上亢證腎臟損害的改善作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

自發性高血壓大鼠32只，雄性，8周齡，體質量（200±10）g。正常清潔級，SD（Sprague Dawley）大鼠6只，雄性，8周齡，體質量（200±10）g。以上大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。實驗室定期消毒、清潔，保持通風，溫度20～25 ℃、濕度（55±2）%。實驗前，大鼠適應性飼養1周，自由進食飲水。實驗中遵循3R原則，實驗通過北京中醫藥大學倫理委員會審議（倫理審批號：BUCM-4-2019-092402-3070），符合動物倫理委員會的要求。

1.1.2 藥物

附子湯（由北京中醫藥大學第三附屬醫院中藥房提供）、天麻鉤藤顆粒（成都九芝堂金鼎藥業有限公司，國藥準字Z51021084）、尼莫地平片（亞寶藥業集團股份有限公司，國藥準字H14022821）。

1.1.3 試劑與儀器

蘇木精染液（Beyotime，貨號：C0107）;伊紅（北京索萊寶生物技術有限公司，貨號：G1100）;核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3，NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（Apoptosis-associated Speck-like Protein，ASC）、胱天蛋白酶（Caspase-1）Elisa試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，貨號：JM-05426H1）;DAB顯色試劑盒（中山金橋，貨號：ZLI-9018）;免疫組織化學抗原修復套盒（北京諾博萊德科技有限公司，貨號：MYZHXFTH）;大鼠無創尾動脈測壓儀（北京軟隆科技有限責任公司，型號：Softron BP-2010A）;酶標儀（BioTek公司，美國，型號：ELX800）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：BX51）;脫色搖床（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

分組：32只SHRs隨機分為自發性高血壓組（對照組）、自發性高血壓肝陽上亢證（模型組）、天麻鉤藤顆粒觀察組（中藥組）、尼莫地平片組（西藥組）各8只。

模型制備：附子湯制備方法：90 g單味制附子浸泡30 min，煎煮2次，將2次藥液合并濃縮為含生藥量為0.2 g/mL的藥液，4 ℃保存備用。參照鄢東紅等[5]的方法，給SHRs灌服附子湯，10 mL/（kg·d），相當于生藥用量為2 g/（kg·d），共灌服28 d。灌服后，大鼠出現煩躁、眼結合膜充血、飲水量增加等癥狀，證明肝陽上亢證造模成功。

1.2.2 給藥方法

正常成年人天麻鉤藤顆粒服用劑量是30 g/d，尼莫地平片的劑量是60 mg/d，根據人與大鼠的換算系數6.25計算，大鼠天麻鉤藤顆粒和尼莫地平的灌胃劑量分別是3.125 g/（kg·d）、6.25 g/（kg·d），用蒸餾水把天麻鉤藤顆粒、尼莫地平片分別配制成0.312 5 g/mL、0.625 g/mL的藥液，4 ℃保存備用。其中模型組、中藥組、西藥組大鼠適應性喂養5 d后10 mL/（kg·d）灌服附子湯制造肝陽上亢證模型。28 d后，再分別給予蒸餾水、天麻鉤藤顆?；鞈乙?、尼莫地平水溶液灌服14 d進行治療干預。另取6只正常SD大鼠作為空白組，對照組、空白組均給予蒸餾水灌服42 d。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 毛發、眼結合膜改變情況及24 h飲水量變化

依次觀察所有大鼠毛發、眼結合膜充血情況及24 h飲水量變化，造模前后分別檢測1次。

1.2.3.2 血壓測量

各組大鼠分別于干預前、后進行血壓測量，每只大鼠在靜息狀態下測量3次，取平均值。

1.2.3.3 血清指標檢測

干預結束后，5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取腹主動脈血5 mL于抗凝采血管中，4 000 r/min轉速離心3 min，離心半徑16 cm，重復3次，分離血清后采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測血清中NLRP3、Caspase-1、ASC的水平，每只大鼠檢測2次取平均值。

1.2.3.4 腎臟病理學切片

腹主動脈取血后，每組隨機選取4只大鼠，剝離腎臟組織，4%的多聚甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，進行連續切片，厚5 μm，每片相距30 μm，常規脫蠟后行蘇木精-伊紅（HE）染色，于200倍鏡下拍照。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠毛色、眼結合膜及24 h飲水量的變化

造模前各組大鼠飲水量、毛色、眼結合膜觀察差異無統計學意義（P>0.05）。模型組、中藥組、西藥組給予附子湯灌服28 d后，出現毛發蓬松無光澤，眼結合膜呈明顯充血狀，顏色加深。模型組、中藥組、西藥組較空白組、對照組飲水量顯著增加（P<0.05），呈現與人相似的口渴、煩躁、目赤等肝陽上亢證表現，提示造模成功。見表1。

2.2 各組大鼠體質量、血壓測量結果

干預前，與空白組大鼠比較，對照組、模型組、中藥組、西藥組血壓均較高（P<0.05），提示SHRs較SD大鼠血壓高，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。對照組、模型組、中藥組及西藥組組間差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。干預前后中藥組血壓變化不明顯（P>0.05）。干預后，西藥組收縮壓明顯降低（P<0.01），西藥組舒張壓與中藥組收縮壓、舒張壓變化不明顯（P>0.05），其他組血壓值較空白組高（P<0.01）。各組體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠血清炎癥介質檢測結果

NLRP3、Caspase-1、ASC3血清炎癥介質檢測結果顯示，中藥組、西藥組較空白組水平升高（P<0.05），較對照組、模型組水平降低（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠腎臟病理學HE染色結果

腎臟HE實驗結果顯示，與空白組比較，對照組、模型組、中藥組、西藥組均出現腎小球缺血性表現，并見腎小球固縮，部分腎小球纖維化和玻璃樣變，腎小管萎縮、甚至消失，其中中藥組、西藥組較對照組、模型組2組病變有所減輕。見圖1。

3 討論

高血壓是常見的心血管系統疾病，由高血壓導致的腎損害的發病率也在逐年上升。該病在西方國家常見，據統計顯示，高血壓是終末期腎衰的第2位病因[6]。對于高血壓導致腎損害的發病機制，有學者提出了炎癥反應在高血壓腎損害發病中的重要作用，其中NLRP3炎癥小體與高血壓及腎臟疾病的發生密切相關[7-8]。

NLRP3炎癥小體是由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶前體（Pro-Caspase-1）組成的一種多蛋白多聚體，在受到氧化應激、微生物感染等刺激因子作用時被激活成巨大的炎癥小體復合物，作為該炎癥反應的上游因子，能夠誘導產生C反應蛋白（C-reactive Protein，CRP）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）等多種下游炎癥介質[9]。研究發現，高血壓腎病的發病與體內IL-1β、TNF-α、CRP等炎癥介質水平密切相關[10-11]。實驗中，腎臟HE染色結果顯示對照組、模型組、中藥組、西藥組均出現不同程度的腎小球缺血、固縮，部分腎小球纖維化和玻璃樣變，腎小管萎縮、消失等表現;結合酶聯免疫吸附試驗法檢測結果，即對照組、模型組、中藥組、西藥組血清炎癥介質NLRP3、Caspase-1、ASC水平較空白組明顯升高。證明了高血壓狀態下，炎癥反應在腎損害發病中的重要作用。姜玉紅等[12]在實驗中亦發現腎衰竭患者血清炎癥介質升高，與本實驗研究結果相似。

治療上，對于高血壓導致的腎損害，西醫尚無有效的治療措施，多以控制原發病、降低蛋白尿、護腎為主，雖能有效降低血壓、改善腎功能，但對控制炎癥反應、改善腎臟微循環效果欠佳，故無法控制腎損害的發展進程。中醫方面，根據其頭暈、目眩、腰膝酸軟、小便不利或夜尿頻多等癥狀，可歸為“眩暈”“水腫”“癃閉”等范疇[13]。在高血壓證型中，肝陽上亢證更容易引起腎損害[14]。多因肝陰虧虛日久累及腎陰，腎陰虧虛，抑制功能減退，腎封藏作用失職，關門不利，致夜尿頻多，或久病陰損及陽，腎陽不足，蒸騰氣化無力，氣不化水，故小便不利等。腎臟組織缺血、固縮、萎縮等病理結果亦是中醫理論中肝陽亢于上、陰血虧于下的道理?；诟侮柹峡旱幕静C，多采用平肝潛陽、補益肝腎的方法治療。天麻鉤藤飲是治療肝陽上亢證的經典方劑，原方出自胡光慈的《中醫內科雜病證治新義》，由天麻、鉤藤、石決明、黃芩、梔子、益母草、牛膝、桑寄生、杜仲、茯神、夜交藤11味藥物組成。全方合用，共奏平肝潛陽，滋補肝腎之功，與實驗模型方證對應?，F代藥理學研究發現，天麻鉤藤飲可以降低血管緊張素，并能有效干預腎素-血管緊張素-醛固酮系統[15]。此外，天麻鉤藤飲還能改善血管內皮功能，抑制鈣離子內流，調節離子通道，從而發揮降壓作用[16-18]。中醫通過辨證論治，整體考慮治療方案，靈活選方用藥，可有效延緩高血壓導致的腎功能損傷發展進程[19-20]。7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F

在本實驗中，用加灌附子湯28 d的方法復制了高血壓肝陽上亢證模型。進行造模的3組（模型組、中藥組和西藥組），出現毛發蓬松無光澤，眼結合膜呈明顯充血狀，飲水量明顯增加，與人類肝陽上亢證癥狀相似，提示造模成功。干預后，血清學指標方面顯示，與模型組、對照組比較，中藥組、西藥組血清中的上游炎癥介質NLRP3、ASC、Caspase-1水平顯著降低。病理方面，中藥組、西藥組腎小球缺血、固縮、纖維化及腎小管萎縮程度較對照組、模型組明顯減輕。由此認為天麻鉤藤飲能夠顯著降低血清中NLRP3、ASC、Caspase-1水平，從該通路上游抑制炎癥反應的發生，從而減輕腎臟組織損傷程度。

綜上所述，實驗結果顯示天麻鉤藤顆粒對高血壓大鼠肝陽上亢證導致的腎臟損害具有改善作用，其作用機制可能與抑制炎癥小體的活化，進而控制腎臟局部炎癥反應有關，這為高血壓腎病后期的中醫治療提供了理論依據及思路指導。本實驗不足之處為干預前后中藥組血壓變化不明顯，考慮干預時間較短造成結果偏倚性較大，這些欠缺將在后期的實驗中進一步完善。

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（2020-08-30收稿 本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81373591）——芎芷地龍湯對偏頭痛模型三叉神經血管系統PKC通路調節作用的研究;北京中醫藥大學第三附屬醫院在讀研究生項目（2019-XS-ZB13）作者簡介：孫治琪（1995.01—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫藥防治心腦血管疾病的研究，E-mail：460332057@qq.com

通信作者：劉子旺（1972.08—），男，博士，主任醫師，研究方向：中醫藥防治心腦血管疾病的研究，E-mail：liuziw@163.com7BD29904-7E78-49C3-88D8-9C2070DC7F5F