BRA V600E 抗體的幾種手工免疫組化染色方法在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況比較＊

廖子龍 張培榮 吳 澤

1.深圳市鹽田區人民醫院病理科 (廣東 深圳 518000)

2.中南大學湘雅醫院病理科 (湖南 長沙 410008)

BRAF基因是一種原癌基因，BRAFV600E位點突變導致細胞惡性增殖，從而促進腫瘤的發生發展。近年來學者發現BRAFV600E突變與甲狀腺乳頭狀癌發病密切相關[1]。通過BRAF V600E基因檢測與HE染色技術發現，BRAFV600E在甲狀腺乳頭狀癌患者中的突變比例達90%[2]。而BRAFV600E抗體是一種鼠單克隆抗體(克隆VE1)，是針對BRAF突變氨基酸序列(氨基酸596到606 GLATEKSRWSG)的人工合成肽。全部實體瘤中約有8%可檢出BRAFV600E突變，其中包括39%的乳頭狀甲狀腺癌[3]。該抗體在免疫組化病理層面的臨床應用有著重要的意義；特別在只能手工免疫組化染色的醫療單位，為其提供一項具有操作較為簡單、費用低等優點的方法，也將給患者提供更有效的診斷證明和檢查項目的選擇。實驗方法如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取甲狀腺乳頭狀癌腫瘤標本，其中BRAFV600E在腫瘤細胞中強陽性表達的組織5例，采用相同的高壓修復方式和同一批號的羅氏一抗試劑。以二抗滴加HRP30min設為實驗組1，滴加ES(反應放大劑+高敏型酶標抗小鼠/兔IgG聚合物)并根據放大劑和聚合物的不同作用時間設為實驗組2～8，分別為實驗組2(放大劑15min+聚合物15min)、實驗組3(放大劑30min+聚合物15min)、實驗組4(放大劑60min+聚合物15min)，實驗組5(放大劑30min+聚合物20min)，實驗組6(放大劑30min+聚合物30min)，實驗組7(放大劑30min+聚合物45min)，實驗組8(放大劑30min+聚合物60min)，以使用全自動免疫組化儀配套羅氏試劑染色設立對照組；在相同條件下同時進行染色。

1.2 切片前期處理常規切片(厚3～4μm)，電熱恒溫箱65°C烤片2h以上，二甲苯脫蠟10min×3－無水酒精2min×2－95%酒精1min－90%酒精1min－80%酒精1min－水洗。

1.3 試劑與儀器BRAFV600E(VE1)抗體；DAB染色試劑盒：(1)Optiview Peroxidase Inhibiror(3%)；(2)Optiview HQ Universal Linker；(3)Optiview HRP Multimer；(4)Optiview DAB；(5)Optiview H2O2(0.04%)(6)Optiview Copper(上海羅氏診斷產品有限公司)。EDTA(PH9.0)修復液、HRP、ES、加強型DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。DHP-420型電熱恒溫培養箱(北京市永光明醫療儀器有限公司)。BenchMark XT 全自動免疫組化儀(上海羅氏診斷產品有限公司)。

1.4 免疫組化染色流程(1)全自動免疫組化儀染色：按照BRAFV600E該抗體設定好的染色程序進行染色，封片。(2)邁新試劑染色流程：EDTA(PH9.0)高壓修復噴氣后計時5min－H2O2(3%)37°C反應10min－BRAFV600E抗體37°C孵育60min－HRP 37°C孵育30min或ES 37°C孵育(按不同實驗組設定的時間)min－加強型DAB顯色試劑盒37°C作用10min－復染、封片。每個步驟間均用PBS+Tween 20液進行清洗3次，每次3min。

1.5 結果判讀染色好的切片由副高以上病理診斷醫師以及主管技師共同閱片，這種突變特異性抗體表現為一種細胞漿染色模式，對腫瘤BRAFV600E抗體明確表達部位進行對比分析，以對照組染色結果為標準，判斷其表達強度；結果以陰性(-)、弱陽(+)、中陽(++)、強陽(+++)進行標注比較[4]。

2 結 果

實驗組1和實驗組2，表達均為(-)(見圖1)。而5例實驗組3、4以及2例實驗組5表達為(+)；5例實驗組6、3例實驗組5以及1例實驗組8表達為(++)；除了1例實驗組8表達為(++)，其余實驗組7、8均表達為(+++)。5例標本中對照組對BRAF V600E抗體均表達為(+++)(見圖2)。

圖1 BRAF V600E陰性(-)。圖2 BRAF V600E強陽性(+++)。

組實驗進行比較，5例標本在相同條件下呈現較高的一致性。實驗組7和實驗組8的表達強度與對照組的表達強度基本一致，但實驗組7時間較短；該方法可用于甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E抗體免疫組化項目檢測。

3 討 論

近年來，甲狀腺乳頭狀癌作為甲狀腺癌的主要腫瘤類型，其發病率逐年增高。研究表明，BRAF基因V600E突變檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中具有重要的臨床應用價值，該基因突變與甲狀腺外侵犯、淋巴結或遠處轉移、腫瘤進展或復發密切相關[5-6]?；诨驒z測時間長、費用高等因素，BRAFV600E抗體逐漸開始應用于病理免疫組化檢測中。由于該抗體檢測條件要求較高，目前并沒有一個公認的較好的手工免疫組化操作方法。目前在羅氏全自動免疫組化儀加強型試劑染色效果較好，但仍有部分基層單位因各種原因未能使用全自動免疫組化儀；本項目通過對羅氏全自動染色流程的解讀，對修復條件以及不同試劑的不同孵育時間進行摸索并試驗，確定BRAFV600E抗體手工免疫組化染色的最佳染色條件[7-8]。實驗結果顯示，5例標本中對照組BRAFV600E抗體均表達為強陽性。各實驗組間的表達結果呈現較高的一致性；其中實驗組1和實驗組2，結果顯示均為陰性(-)，未能表達BRAFV600E抗體。而5例實驗組3、4以及2例實驗組5表達為弱陽性(+)；5例實驗組6、3例實驗組5以及1例實驗組8表達為中陽性(++)；除了1例實驗組8表達為中陽性(++)，其余實驗組7、8均表達為強陽性(+++)(表1)。提示適當增加反應放大劑和高敏型酶標抗小鼠/兔IgG聚合物的反應時間可以增強表達效果；從實驗組2至實驗組7的表達強度上看，試劑1(反應放大劑)反應時間為30min的表達強度最佳，與反應時間為60min的表達強度是一致的；試劑2(高敏型酶標抗小鼠/兔IgG聚合物)隨著時間延長表達強度明顯增強，但反應30min與45min強度基本一致。因此，從表達強度和時間上考慮，選擇反應30min最理想。在染色成本方面，主要計算一抗修復液、一抗試劑、二抗試劑以及顯示試劑費用，該數據為根據廠家采購價粗略計算；實驗組1每人份為42.12元，實驗組2～8每人份為41.99元，對照組每人份為103.7元；如此看來，使用全自動免疫組化儀的染色成本明顯高于手工染色，這也是一部分單位考慮的因素。在完成染色時限方面，從抗原修復開始至DAB顯色結束進行計時，實驗組1與實驗組2用時最短，均為117min，實驗組4與實驗組8用時較長，為162min，實驗組3、5用時132min，實驗組6用時137min，實驗組7用時為147min，而全自動免疫組化儀染色時間最長，為248分min，明顯高于手工染色時間(表1)。

表1 5例實驗組以及對照組的時效性、經濟性對比情況

綜上所述，本實驗結果表明，使用全自動免疫組化儀染色效果最理想，但涉及儀器采購問題，染色時間較長，染色成本也較高； 而手工免疫組化染色中實驗組7的染色效果較理想，能滿足于病理診斷，染色時間較全自動免疫組化儀短，其費用也更低；為滿足基層單位BRAFV600E抗體手工免疫組化染色的需求，本實驗提供兩家不同廠家、不同染色條件的手工免疫組化染色方法，可根據各單位需求做出選擇?；谑止と旧徒Y果判讀上仍存在一定的人為因素，判讀結果存在個別差異性。另本實驗由于病例數較少，未能產生統計學意義，數據還需進一步積累分析；并且單一廠家實驗試劑較局限，其他廠家試劑對BRAFV600E抗體的表達情況如何？還需進一步實驗摸索。