云南溝谷雨林建群種絨毛番龍眼居群的遺傳多樣性

陳少瑜　李江　陳偉　馮弦

摘要：【目的】了解云南特有的溝谷雨林主要建群種絨毛番龍眼居群的遺傳多樣性及遺傳結構特征，為雨林植被恢復的采種規劃和恢復效果評估提供重要參考?！痉椒ā坎捎肧SR分子標記技術，檢測分析云南省西雙版納州和普洱市思茅區的絨毛番龍眼3個天然居群和1個人工居群共82個樣本的SSR多態性，采用POPGENE v.1.32、GenAlEx 6.501和STRUCTURE 2.3.3等進行遺傳多樣性及遺傳結構分析?！窘Y果】19對SSR引物共檢測到88個等位基因，每對引物平均4.632個，19個位點的Shannon’s信息指數（I）變化范圍為0.264～1.687，平均為0.879;多態信息指數（PIC）變化范圍為0.128～0.729，平均為0.422，期望雜合度（He）的變化范圍為0.138～0.765，平均為0.473;4個居群I和He的均值分別為0.785，0.437。19個位點的遺傳分化系數（F）均值為0.069，基因流（Nm）的均值為3.363。STRUCTURE分析將絨毛番龍眼4個居群82個樣本分為4個類群，基于遺傳距離的UPGMA聚類顯示4個居群聚為2個分支，菜陽河天然林居群、普文人工林居群和普文天然林居群聚為一支，勐養鎮天然林居群單獨為另一支?！窘Y論】絨毛番龍眼的遺傳多樣性處于中等水平;居群間的遺傳分化較低，遺傳變異主要來源于居群內;建議特別關注居群內個體的選擇和保護，在溝谷雨林植被恢復中設定天然居群多樣性水平的恢復目標，并通過科學的采種規劃實現這一目標。

關鍵詞： 絨毛番龍眼;SSR分子標記;珍稀瀕危樹種;溝谷雨林建群種;遺傳多樣性

中圖分類號： S718? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0850-09

Genetic diversity of Pometia tomentosa， a major constructive species of valley rainforest in Yunnan

CHEN Shao-yu LI Jiang CHEN Wei FENG Xian

（1Yunnan Academy of Forestry and Grassland/Laboratory for Conservation and Breeding for Rare， Endangered and Endemic Forest Plants of State Forestry Administration/Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Utilization of Forest Plants， Kunming， Yunnan? 650201， China; 2Institute of Forest Research，Yunnan Academy of Forestry and Grassland， Kunming， Yunnan? 650201， China; 3Institute of Forest industry， Yunnan Academy of Forestry and

Grassland， Kunming， Yunnan? 650201， China）

Abstract：【Objective】Pometia tomentosa is a rare and precious local tree species in Yunnan Province of China and it is also one of the major constructive species for valley rainforests. Understanding the genetic diversity and genetic structure of Pometia tomentosa could provide a guide for a seed collecting strategy to effect vegetation restoration in valley rainforests. 【Method】Four populations with a total of 82 samples of Pometia tomentosa from the Xishuangbanna prefecture were studied. Simple sequence repeat（SSR） molecular technique was used to detect polymorphism of allelic fragments. POPGENE， version， 1.32 GenAIEx 6.501 and STRUCTURE 2.3.3 were used to analyze the genetic diversity and genetic structure of populations. 【Result】Eighty-eight alleles were detected by 19 pairs of SSR primers with an average of 4.632 per pair. The range of Shannon’s information index（I） was 0.264-1.687 with a mean of 0.879. Polymorphism information content （PIC） varied from 0.128 to 0.729 with a mean of 0.422， while expected heterozygosity （He） varied from 0.138 to 0.765 with a mean of 0.473. The average values of I and He for the 4 populations were 0.785 and 0.437 respectively. The average of genetic differentiation （F） was 0.069 and gene flow （Nm） was 3.363，which means a relatively low genetic differentiation among the populations. The 4 populations were divided into 4 groups based on STRUCTURE analysis. UPGMA clustering indicated that the 4 populations were clustered into 2 branches， one of which consisted of a natural population in Caiyanghe， an artificial population in Puwen and a natural population in Puwen. The other branch contained only a natural population in Mengyang. 【Conclusion】 The genetic diversity of Pometia tomentosa is only medium at both the species and the population levels. Genetic variation comes mainly from within populations， so individuals within populations should be targeted for selection and conservation. In the recovery of valley rainforests， the genetic diversity of natural populations could be set as a target， which can be achieved by scientific planning of the seed collection.

Key words： Pometia tomentosa; SSR molecular markers; rare and precious species; constructive species for valley rainforest; genetic diversity

Foundation items： Central Financial Forestry Science and Technology Promotion Demonstration Project（Yun 2021-TG02）;Team Building Project of Yunnan Academy of Forestry and Grassland Sciences（LKYTD-2020-003）

0 引言

【研究意義】絨毛番龍眼[Pometia tomentosa（Bl.） Teysm. et Binn]為無患子科（Sapindaceae）番龍眼屬（Pometia）常綠大喬木，瀕危種，國家三級保護植物，在我國主要分布于云南西南部的永德和滄源、南部的景洪、思茅、勐臘和金平以及東南部的麻栗坡等地區海拔475～1500 m的溝谷季雨林中，為云南南部季節性雨林的主要建群樹種。絨毛番龍眼樹體高大、生長速度快，材質優良，抗腐抗蟲能力強，成為云南特有的優質珍貴鄉土用材樹種，但由于生境的破壞、人為的濫砍亂伐已導致該物種的瀕危（文彬等，2002）。群體遺傳多樣性和遺傳結構的研究對物種科學保護及合理利用具有重要的理論和實踐意義（Wuyun et al.，2015），對制定諸如優先保護種群的確定、有效的取樣策略等物種保護策略及近交衰退種群的恢復策略起重要作用（Millar and Westfall，1992），也可為揭示物種演化歷史和進化潛力，探討物種瀕危原因提供科學參考（Hedrick，2004）。由此，開展絨毛番龍眼居群遺傳多樣性研究將為其合理保護及植被恢復中采種策略的制定、效果評價提供科學依據?！厩叭搜芯窟M展】對絨毛番龍眼的研究僅見種子萌發（文彬等，2002;閆興富和曹敏，2008a）、育苗技術（邱瓊等，2014，2015）、生理生態（閆興富和曹敏，2007，2008b;于洋等，2007）及植被恢復（段宗亮等，2012）等方面的報道，遺傳多樣性研究尚為空白。盡管基于分子標記的絨毛番龍眼遺傳多樣性研究尚未見報道，但對于無患子科其他屬植物的相關研究有較多報道。刁松鋒等（2016）利用12條ISSR引物分析了無患子18個天然居群共265單株的遺傳多樣性，表明無患子以自交為主，其天然居群遺傳多樣性豐富，居群內的遺傳多樣性高于居群間;姜翠翠等（2016）應用ISSR分析了來自5個不同種源地的73份無患子種質的遺傳多樣性，結果顯示其遺傳多樣性較為豐富，各種源地種質間的遺傳差異較大;李冬波等（2020）利用40對SSR引物對廣西原產和引種的88份荔枝種質資源進行遺傳多樣性和聚類分析，結果表明SSR分子標記是一種適用于荔枝資源遺傳多樣性分析的理想分子標記，廣西荔枝種質資源遺傳背景相對較窄，遺傳多樣性較低;胡福初等（2021）利用SRAP分子標記對30份早熟荔枝種質資源進行多樣性分析及聚類，結果表明30份資源具有較為豐富的遺傳多樣性，大部分特早熟資源聚在一起。關于龍眼屬種質的遺傳多樣性已有較多報道（陳虎等，2012;鄭姍等，2016）。胡文舜等（2019）基于龍眼品種香脆果實的轉錄組測序數據庫，開發出50對龍眼EST-SSR多態性引物，在無患子屬、韶子屬、荔枝屬和龍荔屬等8份近緣屬材料上進行通用性鑒定，并用之進行了無患子科5個屬55份種質的遺傳多樣性分析，結果表明LYP1-3、LYP2-8和LYP2-11等13對引物在全部5個屬上均有擴增條帶，具有共同通用性，表明龍眼EST-SSR引物在無患子科植物中具有良好的屬間通用性;同時，UPGMA聚類分析將55份材料在遺傳相似系數0.561處明顯地劃分為龍眼、龍荔、荔枝、無患子和紅毛丹5個大類。然而，本課題組將上述龍眼開發出的50對引物用于絨毛番龍眼的SSR擴增，卻未得到理想的擴增效果?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于絨毛番龍眼所處的瀕危狀態、特殊的生態地位及重要的經濟價值，盡管已有育苗和生理生態方面的研究報道，但至今卻沒有對之進行基于分子標記的遺傳多樣性分析，不了解其遺傳多樣性狀況，更是缺乏在此基礎上的合理保護和科學利用?！緮M解決的關鍵問題】在絨毛番龍眼轉錄組測序及引物開發的基礎上，利用SSR標記技術對絨毛番龍眼4個居群82份資源進行遺傳多樣性及聚類分析，揭示絨毛番龍眼居群的遺傳多樣性狀況及遺傳結構特征，為其保護及植被恢復中采種策略的制定、效果評價提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

于2020年5月從西雙版納傣族自治州普洱市思茅區采集絨毛番龍眼4個居群共82單株的葉樣。各居群的名稱、樣本數量及地理信息見表1。將野外分單株采集的葉片置樣品袋中，放入裝有硅膠的密封盒中干燥，備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（擎科生物技術有限公司）提取絨毛番龍眼葉片的基因組DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。

1. 2. 2 SSR引物的篩選 對絨毛番龍眼的轉錄組進行測序，根據轉錄組測序的生物信息學分析得到的SSR位點引物信息，按照SSR引物篩選原則初步選擇并合成200對引物，分別以4個居群隨機抽取的3個DNA樣本為模板進行PCR擴增。用最后擴增良好的熒光PCR產物進行3730xl測序儀檢測，采用GeneMapper V4.1對檢測到的數據進行分析，篩選出的具有多態性的引物用以所有樣本的擴增。

1. 2. 3 擴增體系及擴增程序 按照表2的反應體系進行SSR-PCR擴增，擴增程序如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 5 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物（2 μL）與6 μL溴酚藍混勻進行瓊脂糖電泳（300 V，12 min），得到電泳膠圖，由膠圖判斷模板濃度，基于模板濃度將擴增產物用水稀釋至毛細管電泳所需濃度。

1. 2. 4 毛細管電泳檢測 按130∶1的比例將HiDi與GS500的內標混合成mix，將mix以每孔10.0 μL分裝于國產96孔反應板，之后按編號在96孔板中依次加入0.5 μL檢測樣品，離心至4000 r/min即停。將孔板在金屬浴加熱器上95 ℃預變性5 min，取出立即放入-20 ℃冷卻，取出后4000 r/min離心，混勻，于3730測序儀上進行毛細管電泳，獲得電泳圖譜。

1. 3 遺傳分析方法

1. 3. 1 數據矯正及整理 以條帶大?。╞p）的方式統計每個個體的擴增位點，根據GeneMapper V4.1分析得到的峰圖，以信號值大于400，無雜峰干擾，且同一位點的峰形相似進行位點統計，建立原始數據矩陣。

1. 3. 2 遺傳多樣性分析 用POPGENE v.1.32和GenAlEx 6.501（Peakall and Smouse，2012），分別計算SSR位點和居群的遺傳多樣性指標，包括觀測等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、Shannon’s信息指數（I）、多態信息指數（PIC）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）。

1. 3. 3 遺傳分化分析 用GenAlEx 6.501計算各位點的近交系數（FIS）、基因流（Nm）及居群間的遺傳分化系數（FST）。

1. 3. 4 遺傳結構分析 用STRUCTURE 2.3.3（Pritc-hard et al.，2000）的貝葉斯聚類法分析群體的遺傳結果。用馬爾科夫鏈（Markov chain monte carlo，MCMC）方法預設群體分組（K），K值設置為2～10，每個K值重復運行20次，每個循環的重復抽樣次數設置為100000次，采用Evanno等（2005）的方法計算最適K值，結果通過STRUCTURE HARVESTER方法（Earl and Vonholdt，2012）在線計算（http：//taylor0.biology.ucla. Edu/STRucture Harvester/），用Distruct（Rosenberg et al.，2002）繪制群體遺傳結構圖。

1. 3. 5 聚類分析 基于Nei’s遺傳距離，采用NTSYS 2.10對4個居群進行非加權成組配對算數平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 EST-SSR引物及SSR位點的多態性分析結果

基于絨毛番龍眼轉錄組測序及序列信息分析合成200對引物，經初選和復選確定穩定性高及多態性強的19對引物（表3）對所有樣本進行SSR擴增。圖1為引物CSYSSR061和CSYSSR063分別對6個單株樣品擴增結果的毛細管電泳圖譜，圖譜顯示了擴增出的位點及片段大小。19對引物對4個居群82份樣本進行SSR擴增，共檢測到88個等位基因，Na為4.632個。每對引物檢測到的等位基因數2～10個，其中，引物CSYSSR194和CSYSSR041檢測到的等位基因數最多，各10個，而引物CSYSSR047和CSYSSR089則均只檢測到2個。Ne總數為41.348，數值范圍為1.159（CSYSSR089）～4.162（CSYSSR194），Ne的均值為2.176個（表4）。

由表4還可看出，19個位點PIC變化范圍為0.128～0.729，均值為0.422，其中位點CSYSSR194和CSYSSR041的PIC最高，分別達0.729和0.702，位點CSYSSR089顯示的多態信息最低，其PIC為0.128。19個位點中有15個位點的PIC>0.250，具有較高的多態信息，占總數的78.9%。19個位點的I變化范圍為0.264～1.687，均值為0.879;Ho和He的變化范圍分別為0.124～0.716和0.138～0.765，均值分別為0.412和0.473。位點的雜合度可反映群體的遺傳多樣性，當觀測雜合度小于期望雜合度時（Ho<He），說明分析群體內存在一定的近親交配，物種缺乏足夠的雜合子，本研究中，Ho<He表明絨毛番龍眼群體內存在近親交配，導致雜合子不足。

2. 2 絨毛番龍眼居群的遺傳多樣性及遺傳分化分析結果

絨毛番龍眼4個居群（PN，CN，MN和PA）的遺傳多樣性分析結果見表5。I和He可很好地反映居群的遺傳多樣性水平。由表5可看出，4個居群I和He的變化范圍分別為0.752～0.823及0.421～0.455，均值分別為0.785和0.437;各居群間的I和He，即遺傳多樣性水平存在差異，其中CN居群的遺傳多樣性相對較高（I=0.823，He=0.455），而PN居群的遺傳多樣性水平則相對較低（I=0.752，He=0.0.421）。4個居群的Ho均值為0.410，小于He的均值0.437，總體上看，群體缺乏雜合子，而分別比較各居群的Ho和He可見，4個居群中只有PA居群的Ho（0.455）大于其He（0.444），說明PA居群內雜合子占有較高的比例。

絨毛番龍眼4個居群的群體內FIS的變化范圍為-0.055～0.109，均值為0.049，其中只有PA居群的FIS（-0.055）小于0，其他3個居群的F均大于0，19個位點的F均值為0.060，F均值為0.069（表4）。F統計量是反映居群間遺傳分化和居群遺傳結構的重要指標，其中FIS常用以衡量居群內偏離哈迪—溫伯格平衡的程度，當F>0時，居群內發生近親交配，雜合子不足，反之，則說明居群內為異型交配，雜合子過量。本研究19個位點F的均值大于0，在種的水平上，絨毛番龍眼群體內存在近親交配，雜合子不足，但其中有10個位點小于0，說明這10個位點上雜合子過剩;在居群水平上，4個居群中只有PA居群的F小于0，PA居群內行異型交配，雜合子過剩，其他3個居群內存在近親交配。F可很好地反映居群間遺傳分化狀況，當F≤0.15時，居群間的遺傳分化較低，絨毛番龍眼4個居群F均值為0.069，說明絨毛番龍眼居群間的遺傳分化較低，遺傳變異主要來源于群體內的個體，只有6.9%的遺傳變異來源于居群間。

2. 3 絨毛番龍眼居群的遺傳結構特征

通過STRUCTURE 2.3.3的貝葉斯聚類法對絨毛番龍眼進行居群的遺傳結構分析，得到當K=4時ΔK值最大（圖2），表明4個居群82個樣本中存在4個不同類群（圖3），其中，第Ⅰ類群主要包含PN和CN居群的個體，第Ⅱ類群主要包含CN和PA居群的個體，第Ⅲ類群主要包含MN和PA居群的個體，第Ⅳ類群則主要包含MN和CN居群的個體。表6給出了各居群中4個類群的樣本比例，當K=4時，CN居群樣本的基因組成主要來源于第Ⅱ類群（49.47%）和第Ⅳ類群（22.72%），MN基因組成主要來源于第Ⅲ類群（45.19%）和第Ⅳ類群（40.60%），PA基因組成主要來源于第Ⅱ類群（46.87%）和第Ⅲ類群（26.88%），PN的基因組成主要來源于第Ⅰ類群（47.25%）和第Ⅲ類群（24.54%），可見，4個居群是非均質的，存在一定的基因交流現象，但仍具有明顯的遺傳結構。從各居群包含的基因池組分來看，CN和PA居群具有更為相似的遺傳組分，二者的基因組成近50.00%來源于第Ⅱ類群。

2. 4 絨毛番龍眼4個居群的遺傳關系及UPGMA聚類

為進一步了解居群間的遺傳關系，利用POPGENE v.1.32對居群間的遺傳距離進行計算，結果顯示，4個居群中CN與PA間遺傳距離最小，為0.0549，MN與PN間遺傳距離最大，為0.0845（表7）?；贜ei’s遺傳距離進行4個居群的UPGMA聚類，聚類結果顯示在遺傳距離為0.035處4個居群聚成2組，組Ⅰ中，CN與PA聚為一個亞組，PN單獨為一個亞組，組Ⅱ只包含MN一個居群（圖4）?？梢?，CN與PA居群的遺傳相似性較高，而MN與其他3個居群的遺傳相似性均較低。

3 討論

PIC是遺傳多樣性研究中常用的一個指標，用以評估引物的鑒別能力，反映引物提供信息的可靠性（Barkley et al.，2006;Uzun et al.，2011）。通常，當PIC >0.50時，引物的多態性高，提供的信息量豐富，可很好地反映遺傳多樣性;當0.25<PIC<0.50時，引物的多態性及信息量較高，可提供較合理的信息;當PIC<0.25時，引物的多態性低，提供的信息量較少（Wang et al.，2014;李靜等，2020）。本研究中使用的19對引物PIC均值為0.422，其中15對引物的PIC >0.25，占總數的78.9%，因此，研究采用的引物多態性較高，可為揭示絨毛番龍眼的遺傳多樣性提供豐富而有效的信息。

I 和He是衡量種質資源遺傳多樣性的重要參考指標（Wang et al.，2015）。無患子科其他樹種已有一些遺傳多樣性相關報道，無患子18個天然居群265個樣本的I值分別為0.2569（物種水平）和0.1998（居群水平），He分別為0.3909（物種水平）和0.2980（居群水平）（刁松鋒等，2016），46份荔枝種質資源的He為0.355（曾淇等，2010），我國96份荔枝種質資源的I和He分別為0.425和0.270（向旭等，2010）;Nybom（2004）總結了國內外利用SSR分子標記研究長壽命、多年生、遠交、風力傳播種子的林木群體的He均值，為0.647;王滑（2010）對具有相同生活史的核桃（Juglans regia）、深紋核桃（J. sigillata）研究結果顯示，二者He分別為0.605和0.678。本研究中4個絨毛番龍眼居群I=0.785，He=0.437，比較采用相同分子標記的上述相關研究結果，絨毛番龍眼的遺傳多樣性高于無患子科其他樹種，卻低于林木群體的均值及具有相同生活史的核桃，可見絨毛番龍眼具有中等水平的遺傳多樣性。遺傳多樣性是物種生存和進化的基礎，其水平的高低是物種的進化史、分布區、生物學特性、生境及人為活動等因素綜合作用的結果（Souza et al.，2013）。通常，特有種、瀕危種、分布范圍狹窄、自交為主的物種其遺傳多樣性水平較低（Hamrick and Godt，1996），絨毛番龍眼屬于特有種、瀕危種，分布也相對狹窄，其遺傳多樣性水平卻處于中等水平，究竟其原因應與其多年生、長壽命、蟲媒傳粉及異交為主的繁殖方式有關，長期的演化及異交積累了豐富的遺傳變異。自然保護區的建立對于防止生境破壞和分布片段化導致的遺傳多樣性降低也起到了積極作用。本研究中CN居群位于菜陽河國家級自然保護區內，其遺傳多樣性在4個居群中最高便是一個很好的例證。另外，研究結果顯示4個居群的遺傳多樣性由高至低依次為CN、PA、MN、PN，PA是人工居群，其遺傳多樣性并不低于天然居群（MN和PN）的遺傳多樣性，說明通過科學合理的構建絨毛番龍眼人工居群可維持其物種的遺傳多樣性。

絨毛番龍眼居群間的遺傳分化較低，遺傳變異主要來源于居群內的個體。植物居群的遺傳結構受多個內外因素影響，其中繁育系統、基因流和演替階段等顯著影響居群的遺傳分化，是影響遺傳結構的最重要因素（葛頌，1994）。當基因流Nm>1時，說明居群間的基因流較大，能一定程度上降低遺傳漂變產生的居群間遺傳分化;當Nm<1時則說明居群間的基因流較小，居群間因遺傳漂變及選擇作用而產生分化（Hamrick et al.，1992）。本研究居群間的Nm= 3.363（Nm>1），較大的基因流有效地阻止了遺傳漂變，從而降低了絨毛番龍眼居群間的遺傳分化。絨毛番龍眼為異花傳粉，昆蟲是主要的傳粉者，這樣的傳粉特性導致了其較高的遺傳變異，且變異主要存在于居群內。另外，絨毛番龍眼的分布區域較小，昆蟲利于長距離傳粉及種子較易于散布等因素為居群間的基因交流提供了可能性。

基于遺傳距離的UPGMA分析結果CN與PA居群間的遺傳距離最小，二者首先聚為一個亞組，之后與PN居群聚為組Ⅰ，MN單獨為組Ⅱ，說明CN與PA居群在遺傳組成上更為相似，即遺傳相似性更高，STRUCTURE分析也表明CN和PA居群樣本的基因組成主要來源于第Ⅱ類群（分別為49.47%和46.87%），可推測PA居群的種質主要來源于CN居群。從地理距離上看，PN與CN居群的地理距離較近，二者與MN居群的地理距離較遠，可見3個天然居群的遺傳距離關系和地理距離關系相吻合，結果為資源保護策略及育種策略的制定提供有益參考。另外，盡管MN居群與其他3個居群的遺傳距離較大，但4個居群的遺傳組成為非均質，居群間存在基因交流。

4 結論

絨毛番龍眼的遺傳多樣性處于中等水平，居群間分化較小，其遺傳變異主要來源于居群內。在遷地保護時應特別關注居群內個體的選擇和保護;此外在溝谷雨林植被恢復中可設定近似天然林居群多樣性水平的恢復目標，并通過科學的采種規劃實現這一目標。

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（責任編輯 鄧慧靈）