基于SCF/c-kit信號通路探討調胃承氣湯對腦出血急性期大鼠胃腸組織的影響

楊雪琳，唐 明，周立娟，修小惠，安朋朋，王佳寧

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.海慈醫療集團，山東 青島 266011)

胃腸動力障礙是腦出血急性期常見的并發癥之一，其發病率高達61.8%～80%[1-2]，可導致胃腸內容物蓄積，胃腸菌群失調，釋放大量內毒素，進而使胃腸功能衰竭，加重惡化腦出血患者的整體病情[3-4]。因此，早期干預治療腦出血后胃腸動力障礙具有非常重要的意義。近年來，隨著腦腸軸理論的提出，從胃腸方面治療腦病逐漸被重視[5]。早在《中藏經》中即有運用通腑法治療卒中的記載，金元四大家劉完素亦提出對于“內有便溺之阻格”之中風可以運用調胃承氣湯以蕩滌積滯[6]。課題組前期研究證實調胃承氣湯可以促進腦出血急性期患者顱內血腫的吸收，緩解神經功能缺損癥狀[7]；可以增強胃腸動力[8]，保護胃腸黏膜[9]；可以清理腸道，調節腸道菌群[10]，降低血漿大腸桿菌內毒素水平[11]，減輕卒中后內毒素對機體的損害。但是調胃承氣湯促進胃腸平滑肌收縮、調節胃腸動力的具體作用機制尚不明確，因此本研究擬通過觀察調胃承氣湯對腦出血急性期模型大鼠胃腸組織中c-kit、SCF蛋白及mRNA表達的影響，初步探索調胃承氣湯改善胃腸動力的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性清潔級Wistar大鼠40只，10周齡，體重(200±20)g，由山東中醫藥大學實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(魯)2019-0002。動物自由進食、飲水，喂養標準顆粒飼料，室溫25 ℃，相對濕度60%，適應性喂養1周。實驗流程和大鼠處理過程遵循動物實驗管理條例。

1.2實驗藥物及制備 調胃承氣湯組方：大黃12 g、甘草6 g、芒硝9 g，中藥采用顆粒劑，轉換為顆粒共12.6 g，均購于北京康仁堂藥業有限公司。參照《藥理實驗方法學》中人與動物等效劑量換算公式，計算出大鼠中藥的等效劑量為1.134 g/(kg·d)，加入適量蒸餾水配成113.4 mg/mL的懸濁液，于4 ℃保存備用。枸櫞酸莫沙必利片由魯南貝特制藥有限公司生產，規格：5 mg/片，加入適量蒸餾水制備成0.135 mg/mL的懸濁液，于4 ℃保存備用。

1.3實驗試劑與儀器 c-kit抗體(中國wanleibio，批號：WL00125)；SCF抗體(中國wanleibio，批號：WL02436)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光液以及Western洗滌液(中國wanleibio)；Super M-MLV 反轉錄酶、TRIpure裂解液(北京BioTeke)；石蠟切片機(德國Leica)；WD-9405B水平搖床、DYY-7C電泳儀、DYCZ-40D轉移槽(北京六一公司)；Exicycler 96熒光定量PCR儀(韓國BIONEER)；紫外分光光度計(美國Thermo)。

1.4動物建模、分組及干預 將大鼠按照隨機數字法分為假手術組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只。假手術組只進針不注入(作為對照以排除進針損傷顱腦組織對實驗結果產生的影響)；其余組大鼠參考文獻[12],采用自體血注入法制備大鼠腦出血模型，根據神經功能缺損癥狀，按照Longa五級評分法，以1～3分大鼠為造模成功的標準。建模成功后即刻，中藥組和西藥組分別給予113.4 mg/mL的調胃承氣湯懸濁液和0.135 mg/mL的莫沙必利懸濁液10 mL/(kg·d)灌胃，假手術組和模型組予以等容量生理鹽水灌胃，2次/d，均連續灌胃7 d。

1.5觀察指標及測定方法

1.5.1胃腸組織中c-kit、SCF蛋白表達情況 采用Western blot法檢測。常規處死大鼠，分別切取胃、小腸、大腸、盲腸，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。然后經過SDS-PAGE凝膠電泳，轉移蛋白到PVDF 膜，封閉，卵育一抗，卵育二抗，ECL底物發光，將膠片結果掃描進計算機，用凝膠圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。結果用c-kit、SCF條帶平均光密度/β-actin條帶平均光密度表示。

1.5.2胃腸組織中c-kit、SCFmRNA表達情況采用RT-PCR法檢測。取各組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸組織樣本，應用TRIpure裂解液提取樣本總RNA，運用電泳和紫外分光光度法檢測RNA濃度，反轉錄RNA得到cDNA，將cDNA加入到RT-PCR反應體系中,進行擴增，運用ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。引物序列及長度：c-kit 上游5’-TGCCCGAAACAAGTCATCTC-3’，下游5’-TGAGGGTTCAACTTTATCCACAT-3’，產物長度109 bp；SCF上游5’-GATAACCCTCAACTATGTCG-3’，下游5’-TTACTCAAGCCTTCAGAAAT-3’，產物長度135 bp；β-actin 上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3’，下游5’-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’，產物長度155 bp。采用2-ΔΔCT法計算各組織中c-kit和SCF mRNA表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠胃腸組織中c-kit、SCF蛋白表達情況 模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCF蛋白相對表達量均明顯低于假手術組(P均<0.05)，西藥組、中藥組大鼠胃腸各組織中c-kit、SCF蛋白相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，西藥組和中藥組各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1及表1、表2。

表1 假手術組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中c-kit蛋白相對表達量比較

表2 假手術組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中SCF蛋白相對表達量比較

2.2各組大鼠胃腸組織中c-kit、SCFmRNA表達情況 模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCFmRNA相對表達量均明顯低于假手術組(P均<0.05)，西藥組、中藥組大鼠胃腸各組織中c-kit、SCFmRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，西藥組和中藥組各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3及表4。

表3 假手術組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中c-kit mRNA相對表達量比較

表4 假手術組和腦出血急性期各組大鼠胃腸組織中SCF mRNA相對表達量比較

3 討 論

腦出血屬于中醫理論中“中風”的范疇，《金匱要略》中指出中風有“中臟”、“中腑”之分，中臟多偏里、中腑多偏表，清代醫家沈金鰲認為大便秘結是中風病邪入里的標志，故急性腦出血伴半身不遂、昏迷、便秘、舌苔黃膩者辨證多屬中風偏里之中臟，其發病機制與機體氣血逆亂、升降失調有關。氣血逆亂上沖于腦，神竅阻閉，故猝然昏撲，不省人事；氣機失調，樞機不利，影響脾之升清、胃之降濁，氣機更加壅滯，腸腑傳導不暢，腑氣不通，故大便秘結；加之痰濁、瘀血、火熱等邪氣壅滯胃腸道，實邪瘀積肆虐，繼而加重患者的整體病情[13]。正所謂“急則治其標”“上病下取”，故對于腑實不通的急性腦出血患者，在辨證論治的基礎上選用通腑法治療，可以泄逐壅滯、祛邪外出，使氣血調暢，神志清明，達到諸癥皆緩的療效。

現代研究發現，腦出血急性期胃腸動力的改變由中樞及胃腸道神經系統的共同調節而致，胃腸道神經系統的調節主要與Cajal間質細胞(ICC)有關。ICC存在于胃腸神經與平滑肌細胞之間[14]，可以整合胃腸神經信息傳遞至平滑肌細胞，起搏胃腸道的慢波活動[15]，調控胃腸節律性運動[16]，ICC的數量以及形態結構的改變是影響胃腸道動力的直接因素。c-kit受體(CD117)是ICC的特異性標志物，SCF則是c-kit的天然配體，當兩者結合形成二聚體后，迅速發生磷酸化會激活SCF/c-kit信號通路，并通過相應的轉導途徑影響ICC的增生、分化以及表型的維持[17]。機體在毒物刺激、應激、缺氧、炎性介質等外源性因素影響下，c-kit表達會下降，SCF/c-kit信號通路異常改變，ICC數目相應減少、細胞分化也相對不完整，胃腸動力發生障礙；當c-kit表達恢復后，ICC的數目和分化程度可恢復，胃腸動力障礙亦有恢復[18]。因此，從SCF/c-kit信號通路研究胃腸運動障礙性疾病已成為一個嶄新的方向[19]。

本實驗結果顯示，模型組大鼠胃、小腸、大腸、盲腸平滑肌組織中c-kit、SCF蛋白及mRNA表達量均明顯下降；調胃承氣湯及沙莫必利干預后，大鼠胃腸道組織中上述指標均明顯升高。該結果表明腦出血急性期大鼠在機體的應激反應下或由于機體內毒素的增多，導致SCF/c-kit信號通路相關蛋白、基因表達異常，進而影響胃腸運動；而調胃承氣湯可以通過對c-kit、SCF蛋白及mRNA表達的調節，恢復腦出血急性期大鼠胃腸SCF/c-kit信號通路，促進ICC的發育和分化，進而促進胃腸蠕動，改善胃腸動力障礙。然而腦出血急性期胃腸動力障礙的原因有很多，調胃承氣湯是否可以通過調節中樞神經系統改善腦出血急性期胃腸動力障礙，以及調胃承氣湯對ICC的數量及超微結構的具體影響等均有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。