血液涂片制作教學改進的探討

祁根兄，紀麗麗，張慧

摘要：準確識別血液中各種血細胞的形態、構造，并繪出各種血細胞的形態結構圖，是動物醫學專業大一學生在心血管系統這一章節中的實訓技能課。針對此種情況，對血涂片的制作提出改進方法，盡可能減少實驗失敗的幾率，從而提高學生的實習熱情，把學生的注意力吸引到實驗課上來。為圓滿完成實驗教學任務創造了必要條件。

關鍵詞：動物醫學專業;血涂片;制作;血細胞形態;識別

對于絕大多數動物醫學專業的大一學生而言，血細胞形態學鏡檢的學習和實踐較為困難，能將其學好、學精者為數不多，具體表現為學生相關理論知識欠缺，多數學生僅停留在單個血細胞的形態識別上，而欠缺利用血細胞形態學理論課上的內容對各種血細胞進行觀察和總結，實習熱情不高，因此為了激發興趣、調動積極性并保證每個學生積極主動地投入實驗，取得較滿意的教學效果。血細胞形態學鏡檢是血液檢驗的重要內容，也是眾多血液病的基礎診斷技術，同時可為疾病療效判斷提供依據[1]。

1 采血

做血涂片所用血液可以提前采好，也可以現用現采，各有優、缺點，提前采好的優點是可以節約上課時間，缺點在于保存時間過長或溫度不合適，會造成血細胞沉淀和凝集?，F場采集的優點是血液比較新鮮，血細胞在血涂片上分布較均勻，不會造成血細胞的凝集現象。缺點是采血時出現學生之間推來推去或不敢采血的現象，有的同學還會導致采血失敗，耽擱時間，影響實驗順利開展，實驗準備時間會延長，導致課堂秩序混亂和學生注意力會出現分散現象。

2 血液取用

將血液滴加在載玻片上，此方法可采用載玻片的四個邊角中的其中一個尖角蘸取血液[2]，但是蘸取血液的量一定要少，不能太多，若太多會導致血細胞大量堆積和重疊，最后致使無法觀察而讓實驗失敗。也不能太少，太少會導致圖片上可供觀察的血細胞太少。另外也可采用20μL微量移液管來移取血液，吸取5μL就夠了，此法優點是血量的把控準確，缺點是微量移液管使用要熟練，微量移液管使用不熟練者會導致血量把控不準而影響血細胞的觀察。

3 血液涂片

將血液涂布在載玻片上，此方法可以采取用載玻片1的邊緣去推片或拉片的方法[3]。若用左手固定載玻片2，將血滴加在載玻片2右側中央時，可以采用350傾斜使載玻片1先與血滴接觸，等血滴沿載玻片1的邊緣慢慢滲透并擴散開。然后將載玻片1勻速向載玻片2的左側勻速推動，直到將血滴推完為止。這樣血液就均勻涂布在載玻片2上了（如圖1所示）。反之，若將血滴滴加在載玻片2的左側中央時，可以采用350度傾斜，同樣使載玻片1先與血滴接觸，等血滴沿載玻片1的邊緣慢慢滲透并擴散開。然后將載玻片1勻速向載玻片2的右側拉動直到將血滴拉完為止，這樣血液就均勻涂布在載玻片2上了。此操作過程中等待血液沿載玻片1邊緣擴散，這一現象非常重要（如圖2所示）。若不等血滴擴散就推片或拉片，就會造成血細胞堆積和重疊現象。若速度控制不好，會導致血膜涂布不均勻，有的區域有，有的區域無的斑馬線現象，而致使顯微鏡下無法觀察血細胞。

4 干燥

將血液涂布在載玻片2上面后，涂片制成后，應在空氣中快速搖動或扇干，將血膜干燥并固定附著在載玻片上，防止細胞皺縮變形或因空氣潮濕而溶血。

5 染色

采用瑞氏-姬母薩染色法[4]，瑞氏-姬姆薩染液由珠海貝索生物技術有限公司生產，瑞氏-姬姆薩染液試劑由瑞氏-姬姆薩染液（A液），磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）（B液）組成，在pH值為6.8的緩沖液中，血液中的大多數蛋白質均達到或接近自己的等電點，因而能很好地吸附相應的染料而著色。

瑞氏-姬姆薩染色液是利用Romanowsky Stain技術原理改良而成的。細胞的著色過程是染料透入被染物并存留其內部的一種過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學親和作用。各種細胞及細胞的各種成分由于其化學性質不同，對瑞氏-姬姆薩染色液中的酸性染料（曙紅）和堿性染料（亞甲藍）的親和力也不一樣。因此，標本涂片經瑞氏-姬姆薩染色液染色后，相應各類細胞呈現不同的著色，從而達到辨別其形態特征的目的。大一新生第一次接觸到，應向他們說明它包括嗜酸性染料和嗜堿性染料兩部分，因此染色后，細胞中嗜酸性物質呈紅色，嗜堿性物質呈藍色，嗜中性物質呈紫紅色，這對正確理解血涂片上不同種類血細胞呈現不同顏色有較好的幫助。

染色方法：滴加A液約0.5～0.8mL于涂片上，染色1min;再將B液滴加于A液上（滴加量為A液的2～3倍），以洗耳球吹出微風使液面產生漣漪狀，使兩液充分混合，染色4～10min。切記不要使染液蒸發干，若染色時間過長或染液蒸發干，就會導致染料附著太嚴重，而無論怎么水洗都洗不干凈。

另外，染色時間需視何種標本、涂片厚薄、有核細胞多少、何種細胞及室溫等而定;氣溫較低時，可適當延長染色時間。染色結果如出現嗜酸性粒細胞變堿，則考慮是否染色時間太長所致。染液量需充足，勿使染液蒸發干燥，以防染料沉著于涂片上。做血細胞染色時，當天氣寒冷或濕度較大時，應于37℃溫箱中保溫促干，以免細胞變形縮小或在染色時脫片。染液若被裝載于染色機上使用，B液的開封使用時間不宜過長，以免因管路和空氣污染出現絮狀沉淀。染色的好壞固然與涂片的好壞有關，但染料的質量、緩沖液的pH值及染色時間等對其也有重要的影響，而緩沖液的pH值對血涂片染色的影響常被忽視。

6 水洗

水洗（沖洗時不能先倒掉染液，應以流水沖去，以防有沉渣沉淀在標本上），水洗時水流要細小，沿玻片2的邊緣緩慢沖洗，不能用大水流正對血膜直沖，這樣會導致血膜沖落。水洗1～2min后要在顯微鏡下觀察一下水洗的效果，若沒洗干凈，再繼續水洗，水洗過程中要勤觀察，直到洗干凈為止，不然有可能會導致洗不干凈或沖洗時間過長而導致顏色變淡。

7 鏡檢

等水洗完成后，用吸水紙吸掉玻片2上的水分，注意不要擦拭，以免擦掉血膜。將吸掉水分的玻片2置于顯微鏡載物臺上進行鏡檢。紅細胞呈粉紅色，白細胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細胞特有的色彩，細胞核染紫紅色，核染色質結構清楚。白細胞形態上與血細胞涂片的白細胞相同，一般白細胞的多寡，提示發炎程度的高低，對醫師的診斷具有一定的指標作用[5]。血細胞的染色、白細胞中的特殊顆粒均顯示清晰，紅細胞內的血紅蛋白染成桔紅色[6]，中性粒細胞顆粒染成藍紫至紫紅色，嗜酸性粒細胞顆粒染成鮮紅色，嗜堿性粒細胞顆粒染成深紫藍色，淋巴細胞核染成深藍紫色，胞質染成天藍色。單核細胞核染成淺紫色，胞質染成灰藍色[7]。

總之，采血、血液取用、涂片、干燥、染色、水洗等過程每一步都至關重要，稍有疏忽，就會全盤皆輸。因此每一步都要嚴格把握，不可粗心大意，更不能急于求成。以確保實驗過程順利進行，力求制作出清晰、好辨認、標準的血液涂片。

參考文獻：

[1] 方向，蔣婧.血液涂片細胞形態學聯合全自動血細胞分析儀在血常規檢驗中的應用價值分析[J].黑龍江醫學，2021，45（23）：2549-2551.

[2] 南京農學院.家畜生理學實驗指導[M].北京：農業出版社，1982：62-63.

[3] 周其虎.動物解剖生理[M].第3版.北京：中國農業出版社，2019.

[4] 董常生.家畜解剖學[M].第3版.北京：中國農業出版社，2001.

[5] 丁靜，黃世霜，胡延生.骨髓涂片、印片與切片檢查在基層醫院診斷血液疾病中的應用[J].福建醫藥雜志，2020，42（3）：172-174.

[6] 劉春亮.血涂片分析在血常規檢驗中的應用[J].中國醫藥指南，2021，19（18）：89-90.

[7] 鄭秀詩.血涂片染色方法的研究進展知多少[J].家庭生活指南，2019（5）：159.