甲醛與戊二醛固定劑對基于Ludox–QPS染色方法的研究結果對比

王苗勛 許媛

關鍵詞：多樣性;群落結構;微型底棲動物;纖毛蟲;固定劑

0引言

微型底棲動物個體微小且為單細胞，在海洋微食物環中扮演著重要的角色.其蟲體脆弱，在離心分離過程中極易破碎.因此，如何有效地將其從沉積物中分離、固定并染色，成為微型底棲動物生態學研究的技術瓶頸[1-3].徐奎棟等改進的密度梯度離心結合定量蛋白銀染色法（LudoxDensityGradientCentrifugationCombinedwithQuantitativeProtargolStaining，Ludox–QPS）是研究微型底棲動物生態學的重要手段[4-5]，并被納入了《海洋微型底棲生物調查規范》[6]中.

樣品固定是影響Ludox–QPS及后續統計分析的重要因素.理想的固定方法應盡可能少地引起細胞損失以及形態變化，能夠真實地反映微型底棲動物的生活狀況[7].固定方法不當，會導致部分物種丟失或形態破壞，不僅給鑒定造成困難，而且會導致對生物量的評估產生偏差，影響統計的準確性及對群落組成和多樣性的分析[8-9].常見的固定劑類型有甲醛、戊二醛、魯哥氏液（Lugol’s）和波恩液（Bouin’s）等，種類繁多，性能也存在很大的差異[10].類彥立等[4]和Xu等[11]比較了2%戊二醛、4%甲醛、10%Lugol’s液與5%Bouin’s液，認為酸性固定液（Lugol’s液與Bouin’s液）會引起Ludox膠體的凝結，降低固定液的固定效能，不適合Ludox–QPS研究[4，11]，pH值為中性的甲醛溶液與戊二醛溶液恰好滿足其條件.已有的《海洋微型底棲生物調查規范》建議使用終濃度為2%的戊二醛固定底棲纖毛蟲樣品[6]，但由于戊二醛固定的樣品存在長距離運輸受限的問題，使得在大地理尺度上進行微型底棲動物的研究受到限制.而經甲醛固定的樣品在滿足一定條件下可以通過航空托運運輸，因此可滿足實驗樣品的遠距離運輸要求[12].

前人針對浮游類群的研究，發現固定劑類型及濃度會引起部分個體的損失及形態變化，進而影響對生物量的估計[13].Turley等[14]在研究中發現戊二醛固定的浮游生物的數目會隨時間減少，并進一步證實了無論甲醛固定還是戊二醛固定均會引起細胞數量的損失.Choi等[15]發現戊二醛固定引起鞭毛蟲蟲體的收縮小于甲醛固定，而對于寡毛類纖毛蟲而言，甲醛固定引起的收縮反而小于Lugol’s和戊二醛等固定劑.已有的文獻[10，16-18]也提到，甲醛是相對于其他固定劑（如戊二醛）對細胞體積影響最小的.曾鈺婷[19]對臺灣地區近海經甲醛固定及室內培養的浮游纖毛蟲結合定量蛋白銀染色研究發現，甲醛固定不影響“屬”級的鑒定，部分能夠鑒定到“種”級.上述研究均源自浮游樣品或室內培養的有限種的分析結果，而對于底棲類群的報道甚少.迄今，國內外針對固定劑類型對底棲類群影響的研究十分有限，僅有孟昭翠等[20]對采自黃海海域并經甲醛固定的底棲生物樣品的研究，發現底棲鞭毛蟲會隨固定時間延長而造成一定數量的低估.

因此，為對比甲醛固定與戊二醛固定經Ludox–QPS染色后的微型底棲動物群落的研究結果是否具有可比性，本研究于2019年4月在上海南匯邊灘采集了3種生境的微型底棲動物樣品，并分別采用甲醛和戊二醛作為固定劑，后期進行Ludox–QPS染色實驗并對比實驗結果.這為以后采用何種固定劑進行微型底棲動物生態學研究及采用不同固定劑的研究結果是否具有可比性提供相應的研究依據.

1材料與方法

1.1 采樣區域、方法及固定方式

本研究于2019年4月在上海市南匯邊灘（30°51′39″N，121°55′06″E）選取光灘、海三棱藨草灘以及沙灘3種生境（圖1），每種生境隨機選取兩個樣點作為平行樣.

使用直徑約1.5cm的自制采樣器，在每個樣點隨機采集6個表層平行芯樣（0～2cm，約24mL），隨機分成2組（每組3個芯樣），一組使用終濃度1%的甲醛溶液固定，另一組使用終濃度2%的戊二醛溶液固定.

1.2 Ludox–QPS及物種鑒定

Ludox–QPS實驗過程參照《海洋微型底棲生物調查規范》，依次對樣品進行稀釋降鹽、密度梯度離心、真空抽濾、瓊脂包埋、蛋白銀染色、脫水與封片等過程，獲得永久裝片[6].

使用光學顯微鏡（BX53，OLYMPUS，日本）在200～1000倍下進行鏡檢，對目標生物測量長（L）和寬（D）[6].參照宋微波等[21]、Carey[1]和Lynn[22]等分類文獻對纖毛蟲進行鑒定，并根據各自特征進行類群劃分.

1.3 纖毛蟲生物量的計算

通過鏡檢測量纖毛蟲個體的長（L）和寬（D），并根據蟲體最接近的幾何形狀計算體積（V），通過轉換系數對纖毛蟲的生物量進行估算.一般每種纖毛蟲隨機選取20只個體（如果個體不足20只則全部計數）進行測量，最后取平均值[5，23].甲醛固定樣品的轉換系數為0.14pg/μm3，戊二醛固定樣品的轉化系數為0.20pg/μm3[5，24].

1.4 數據分析

利用Primer–E7.0軟件對纖毛蟲豐度數據進行平方根轉換，并計算Bray–Curtis相似性矩陣，在DIVERSE模塊中計算物種數（S）、個體數（N）、香農–維納多樣性指數（H'）和均勻度指數（J'）.公式如下：

對底棲纖毛蟲群落的物種組成、多樣性參數及生物量數據在0.05水平上進行ANOSIM（AnalysisofSimilarities）雙因素（生境類型和固定劑類型）交叉分析[25].并根據Bray–Curtis相似性矩陣進行NMDS（NonmetricMultidimensionalScaling）分析，以顯示不同固定劑、不同生境采集的底棲纖毛蟲群落物種組成的相似性.

2結果

2.1 物種組成

本研究中共檢獲底棲纖毛蟲26科33屬39種，分別屬于側口類、前口類、小胸類、盾纖類、核殘跡類、鉤刺類、腹毛類、寡毛類、膜口類及管口類10個類群.其中，甲醛固定的樣品中檢獲9類26種，戊二醛固定的檢獲10類26種（圖2），剛毛刺葉蟲（Kentrophyllumsetigerum，屬于側口類）為優勢種.

2.2 群落結構

2.2.1ANOSIM雙因子交叉分析

ANOSIM雙因子（生境類型與固定劑類型）交叉分析結果表明：雖然不同生境（光灘、沙灘和海三棱藨草灘）中的底棲纖毛蟲群落之間存在顯著性差異（p<0.05，表1），但兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲群落物種組成、多樣性參數（物種數、個體數、均勻度和香農-維納多樣性指數）以及生物量均無顯著性差異（p>0.05，表1）.

2.2.2NMDS分析

NMDS分析結果（stress=0.11）顯示，兩種固定方式固定的群落結構之間區分不明顯，海三棱藨草灘與其他生境（光灘和沙灘）之間的群落結構存在明顯區分（圖3）.

2.3 底棲纖毛蟲生物量

甲醛固定與戊二醛固定獲得的平均生物量分別為（0.32±0.11）μgC/mL與（0.35±0.07）μgC/mL.兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲生物量在不同生境（海三棱藨草灘、光灘和沙灘）中的分布狀況趨同（圖4），通過ANOSIM雙因子交叉分析結果（表1）可知，底棲纖毛蟲群落的生物量在不同生境間存在顯著性差異（p<0.01），但在兩種固定方式之間不存在顯著性差異（p>0.05）.

2.4 兩種固定方式的Ludox–QPS染色效果

甲醛固定與戊二醛固定的樣品經過Ludox–QPS染色后獲得的纖毛蟲染色圖式如圖5所示.兩種方法獲得的蟲體形態均基本完整，無明顯收縮;纖毛圖式染色尚可;細胞內質著色均勻，且多數個體細胞核清晰可見.可根據其纖毛排列、口區位置及細胞核形狀與數目等結構，將其鑒定到“屬”級甚至“種”級的水平（圖5）.

3討論

3.1 固定劑的性質

甲醛溶液與戊二醛溶液都是微型底棲生態學中常見的固定劑，兩者在性能上存在較大差異[26-30].甲醛穿透能力較弱，對細胞內的超微結構保存效果不佳，僅能夠滿足普通光學顯微鏡觀察的需求;而戊二醛對細胞核以及膜系統的保存能力優于甲醛，對細胞內的超微結構能夠很好地保存，可滿足分辨率更高的電鏡觀察[31].甲醛與戊二醛作為固定劑均會在一定程度上引起目標生物的形態發生變化[13，15]，但也有學者認為，甲醛固定能夠減少蟲體的收縮程度，更能夠客觀地反映實際生物量狀況[15].甲醛溶液與戊二醛溶液不會造成Ludox硅膠液凝結，均適合LudoxHS–40硅膠液對微型底棲動物進行提取[2]，但采用戊二醛固定的樣品還需在冷凍條件下保存.

3.2 兩種固定方式對物種鑒定的影響

本研究采用甲醛固定與戊二醛固定兩種方式結合Ludox–QPS染色獲得的纖毛蟲圖式（圖5），與前人研究中（均由戊二醛固定）采用Ludox–QPS染色獲得的底棲纖毛蟲圖式效果一致[2，5，32]，均可根據體表纖毛結構、口區結構等特征鑒定到“屬”級或“種”級.前人對浮游類群纖毛蟲利用甲醛或戊二醛固定，同樣可以通過形態特征辨別至“屬”和“種”級水平[33-34]，可見兩種固定方式對纖毛蟲種類的辨別無明顯影響.相關研究結果不僅能提供底棲纖毛蟲形態方面的信息，還能計算生態學分析所需的豐度、豐富度、物種數等生物群落數據，數據可用于后續的ANOSIM分析和NMDS分析等過程，為開展微型底棲動物生態學研究提供便利.

3.3 不同固定方式獲得的底棲纖毛蟲群落結構對比

針對甲醛固定與戊二醛固定的采自3種生境的底棲纖毛蟲群落，經過ANOSIM分析（表1），結果表明，其群落的物種組成、4種群落多樣性參數（物種數、個體數、均勻度，香農–維納多樣性指數）以及生物量方面均差異不顯著（p>0.05）.NMDS分析（stress=0.11，介于0.1到0.2之間）同樣表明，同一生境的兩種固定劑固定的底棲纖毛蟲群落的物種組成相似.與Xu等[35]在相同區域的研究比較，優勢種（Kentrophyllumsetigerum）未發生改變，但豐度和多樣性較低，其原因可能與樣品的采集時間或采集強度有關.海三棱藨草灘、光灘和沙灘的多種環境因子存在明顯的差異[35]，是造成物種組成、均勻度、個體數和生物量間顯著性差異（表1，p<0.05）的主要原因.前人在浮游樣品的研究中認為，無論何種固定劑（甲醛或戊二醛）細胞數目隨時間均會在一定程度上影響數據的呈現[36]，在底棲樣品中，孟昭翠等[20]研究發現，甲醛固定的微型底棲動物（鞭毛蟲）樣品保存4個月比保存1個月豐度降低47.4%，但短時間內影響有限.本研究在樣品采集后4d內即完成Ludox–QPS染色，在一定程度上減少了保存時間對定量研究的影響.目前，尚無直接證據表明甲醛與戊二醛兩種固定方式對研究結果產生差異，說明甲醛可作為微型底棲動物的固定劑用于固定Ludox–QPS實驗所需的材料，并且可將其研究結果與戊二醛固定后的研究結果進行比較.

3.4 特殊類群的比較

本研究中膜口類（Maritujapelagica，1種，占1.32%，圖2）僅出現在戊二醛固定的樣品中，未出現在甲醛固定的樣品中，該現象或許與固定劑的固定能力有關.然而，與馬族航[32]對崇明東灘濕地的底棲纖毛蟲群落和劉華雪等[37]對南海區域的微型動物群落的研究對比，前者以戊二醛（終濃度2%）為固定劑，后者以甲醛（終濃度2%）為固定劑，均能固定到大量的膜口類纖毛蟲.本研究中前口類（占32.92%）、側口類（占19.88%）和腹毛類（占13.35%）等類群占極大優勢，與已有的研究結果基本吻合[26，32，35，38]，膜口類在本次研究區域內豐度極低，僅占0.64%.因此，該現象可能是膜口類纖毛蟲在本區域內豐度極低，僅被偶然采集到戊二醛固定的樣品中，而與甲醛的固定能力無關.但也并不排除固定劑會對胞內結構存在一定程度的影響，這需要從細胞學角度進一步研究.

4結論

由上述實驗結果可知，甲醛作為固定劑可結合Ludox–QPS染色開展微型底棲動物生態學研究，這將為在較大地理尺度上開展相關的研究提供便利.本研究表明，采用甲醛和戊二醛兩種固定劑進行Ludox–QPS染色后的研究結果具有可比性.