綠木霉與雙向伯克霍爾德氏菌離體互作機制

王俊凱　鄧勛　邵鵬　宋小雙　宋瑞清

摘要 木霉與根際促生細菌在土傳病害生物防治上具有巨大潛力。該試驗在兼容性篩選基礎上，研究了綠木霉（Trichoderma virens）ZT05與雙向伯克霍爾德氏菌（Burkholderia ambifaria）ZB155在離體條件下，發酵液代謝產物對互相的生長、孢子萌發、生物膜形成及拮抗活性方面的影響，并進行了離體共培養體系構建的初步研究。結果表明：菌株ZT05與ZB155離體條件下具有良好的兼容性。在離體互作研究中，兩個菌株在對互相的生長、孢子萌發、生物膜形成及對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的拮抗作用中表現出良好的兼容性。在活體共培養中，對病原菌的抑制作用同單接種處理差異顯著，其中對峙培養抑制率為38.10%，發酵液抑制率為76.67%，優勢明顯。因此，菌株ZT05與菌株ZB155互作在生防作用上具有巨大潛力。

關鍵詞 綠木霉;雙向伯克霍爾德氏菌;共培養;互作機制

中圖分類號：S718.8 文獻標識碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.001

Interaction Mechanism Between Trichoderma virens and Burkholderia ambifaria in Vitro

Wang Junkai Deng Xun Shao Peng Song Xiaoshuang Song Ruiqing

（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang; 2. Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，Forest Conservation Research Institute，Harbin 150040，Heilongjiang;3. Heilongjiang Key Laboratory of Forest Grassland Fire and Pest control，Harbin 150040，Heilongjiang）

AbstractTrichoderma and rhizosphere growth-promoting bacteria have great potential in the biological control of soil-borne diseases，but the mechanism of interaction between them is less studied. On the basis of previous compatibility screening，the effects of metabolites from the fermentation broth of Trichoderma Virens ZT05 and Burkholderia ambifaria ZB155 on mutual growth，spore germination，biofilm formation and antagonistic activity

in vitro were studied. A preliminary study on in vitro co-culture systems was also carried out. The results showed

that strain ZT05 had good compatibility with ZB155 in vitro. In the study of in vitro interaction，the two strains showed good compatibility to each other's growth，spore germination，biofilm formation and antagonism to Rhizoctonia solani. In the co-culture in vivo，the inhibition of pathogens was significantly different from that of single inoculation. The inhibition rate of confrontation culture was 38.10%，and that of fermentation liquid was 76.67%，showing obvious advantages. In conclusion，the interaction between strain ZT05 and strain ZB155 has great potential in biocontrol，and this study lays a foundation for further studies on the interaction of compound biocontrol bacteria，plant-pathogen.

Key wordsTrichoderma virens;Burkholderia ambifaria;co-culture;interaction mechanism

根際促生細菌（PGPRs，plant growth promoting rhizobacteria）是指定殖于植物根際并能夠促進植物生長的細菌[1]。主要通過生物固氮作用、分泌激素、產生鐵螯合載體、解磷作用等提高植物根際養分吸收能力[2]來提高植物耐旱性、提高產量、促進生長[3-5]。其中，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）作為優良的促生抗逆菌屬，其菌屬的大部分物種擁有許多對植物、環境有益的功能，如生物修復、固氮、促生、誘導植物抗性等[6]，具有多種抑制植物病原真菌活性的功能，能有效抑制黃瓜、胡椒、大豆、草莓和番茄中的尖孢鐮刀菌（ Fusariumo xysporum） 、終極腐霉菌（ Pythium ultimum） 、立枯絲核菌（ Rhi-zoctonia solani） 和齊整小核菌（ Sclerotium rolfsii） 等[7]土傳真菌。在生防作用上具有巨大潛力。因此，雙向伯克霍爾德氏菌屬越來越受到關注，并成為植物根際促生菌的一個研究熱點菌屬。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

木霉（Trichoderma spp.）是一種廣為人知的土傳真菌，在土壤中很常見，能在植物表面和內部定殖為內生真菌[8]，無處不在且高度多樣化。研究表明，木霉可以通過競爭營養物質和空間，利用低濃度營養物質來占領病原菌侵入點[9]，也可主動識別病原菌，以重寄生方式殺死寄主[10]及揮發代謝產物來達到抗生作用[11]。其中，綠木霉（Trichoderma virens）作為木霉的一種，在樟子松促生、抗病方面具有巨大潛力[12，13]，通過競爭營養物質和空間、改變環境條件、促進植物生長、形成植物防御機制和抗生作用，或直接通過真菌寄生等機制對真菌致病菌進行生物防治[14]。

現代農林業的發展要求減少化學藥劑的使用，以多種有益微生物復合使用，同時發揮促生抗逆和土壤修復功能的復合生物菌劑逐漸取代單一菌劑成為未來生物菌劑研究發展的方向，同時復合菌劑的使用可以保障益生菌在多樣的土壤和環境條件下保持高效率、可靠性和一致性[15]。而不同益生菌的兼容性是對植物促生抗病協同增效作用的關鍵因素[16]。Velmourougane等[17]通過調節細菌-木霉共培養體系條件下培養基比例與接種順序，成功證明了細菌-木霉共培養體系在提升生物量、生物膜形成、拮抗能力及胞外多糖方面的能力。證明了木霉-細菌共培養體系作為一種多功能植物生長促進劑和土壤肥力促進劑在土壤肥力研究中的應用。然而，建立共培養體系的微生物之間存在直接或間接的相互作用，可能對生物防治效果產生消極或積極的影響。因此，在兩種生防菌的組合下，生防活性與個體活性相比可以提高、降低或相近[18]。所以，如何篩選出兼容且適合的品種，決定著共培養體系能否成功構建。

在此背景下，本試驗采用從樟子松根際分離篩選得到雙向伯克霍爾德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155，通過與多種優秀的生防木霉菌種進行兼容性評價，進行離體互作的分析及共培養體系的構建來探究其在生防作用上的潛力。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株：雙向伯克霍爾德氏（Burkholderia ambifaria）菌株ZB155、綠木霉（Trichoderma vi-rens）ZT05和T43、哈茨木霉（T. harzianum）T101和T14、綠色木霉（T. viride）5436、立枯絲核菌SH，其中菌株ZB155、ZT05、T101分離自遼寧省章古臺樟子松人工林根際土壤，菌株T14、5436、SH分離自黑龍江省葦河林業局苗圃，菌株T43引自以色列。上述菌株保存于黑龍江省林業科學院森林微生物實驗室。

1.2 菌株培養方法

將-20 ℃保存的菌株ZB155接種在牛肉膏蛋白胨（NB）培養基中，28 ℃、150 r·min^-1振蕩培養48 h后，將發酵液12 000 r·min^-1離心10 min取上清。經0.22 μm過濾膜過濾除菌，得到無菌的ZB155發酵液。

將4 ℃保存的木霉ZT05接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，25 ℃靜置培養。4 d后用無菌打孔器（直徑10 mm）切取菌餅，接種于盛有150 mL PD培養基的250 mL錐形瓶中，每瓶接種3個菌餅，25 ℃、150 r·min^-1振蕩培養4 d。將培養好的發酵液過濾去除菌絲并在12 000 r·min^-1下離心10 min，將發酵液經0.22 μm過濾膜過濾除菌，得到無菌的木霉ZT05發酵液。

木霉ZT05孢子懸液制備：參照陳臻等[19]的方法，將木霉ZT05活化后接種在PDA培養基上，25 ℃靜置培養7 d后，在平板中加入10 mL無菌水，用無菌接種環輕輕刮取，將表面孢子洗脫。無菌水稀釋后用血球計數板測定，調節孢子液濃度為1.0×10⁶cfu·mL^-1。

1.3 木霉與促生細菌ZB155兼容性測定

采用對峙培養方法分別測定5株木霉（包括ZT05、T101、T43、T14、5436）與促生細菌ZB155的兼容性。

參照尹大川等[20]的方法，采用平板對峙培養法：在距PDA平板中央2.5 cm處接種4個10 μLZB155菌液液滴，28 ℃靜置培養。24 h后在PDA平板中央接種木霉，25 ℃靜置培養。以未接種細菌為空白組，當空白組木霉菌落長滿平板時，測量處理組的木霉菌落直徑，并計算抑制率，每個處理3次重復。

抑制率（%）=細菌菌落中心至真菌菌落邊緣距離/細菌菌落中心至真菌菌落中心距離×100

1.4 ZB155發酵液對ZT05生長及生防作用的影響

在前期兼容性測定試驗中，篩選出了具有與菌株ZB155共培養可能性的木霉菌種，在離體條件下測定ZB155發酵液胞外代謝產物對木霉生長及拮抗活性的影響。

1.4.1 對ZT05菌絲生長的影響 將0.22 μm過濾除菌的ZB155發酵液按照1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5個濃度梯度分別加入PDA培養基中，將木霉ZT05接種于平板中央。以不添加ZB155發酵液為對照處理，25 ℃下靜置培養，在培養48 h和96 h時測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.4.2 對ZT05孢子萌發的影響 參照陳雨等[21]的方法，菌株ZT05孢子懸液經含上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V），5個不同濃度ZB155發酵液的0.1%吐溫80溶液處理6 h后，調節孢子濃度至1.0×10⁵cfu·mL^-1后接種于無菌水-瓊脂培養基平板中，25 ℃靜置培養24 h后，在光學顯微鏡40倍鏡條件下觀察分生孢子萌發情況，計算萌發率。

1.4.3 對ZT05拮抗活性影響BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

按照上述方法，將經ZB155發酵液處理的ZT05菌株孢子液接種在PDA平板中，進行平板對峙試驗。

平板對峙試驗中，將立枯絲核菌SH接種在平板中央，在距中心2.5 cm處接種4個10 μLZT05孢子液滴（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃靜置培養4 d。以不接種ZT05為對照組，測量平板中央SH病原菌的菌落直徑并計算抑制率。

抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100

1.5 ZT05發酵液對ZB155生長及生防作用的影響

1.5.1 對ZB155生長的影響 在牛肉膏蛋白胨（NB）培養基中分組添加上述1%、5%、10%、20%、30%（V∶V）5個濃度梯度的木霉ZT05發酵液，以不添加發酵液組為空白對照。28 ℃下震蕩培養48 h后測量OD₆₃₀值。

1.5.2 對ZB155生物膜形成的影響 參照 O'Toole[22]的方法，使用結晶紫法檢測生物膜形成。在牛肉膏蛋白胨（NB）液體培養基中按上述1%、5%、10%、20%、30%（V/V）5個濃度梯度加入木霉ZT05的發酵液，以不加入發酵液為對照，每組3次重復，最終測量OD₅₅₀值。

1.5.3 ZB155拮抗活性的影響 按上述方法，將ZB155經含有上述濃度ZT05發酵液的1%的吐溫80溶液中處理1 h后，進行拮抗對峙試驗。先將4個10 μLZB155菌液接種在距平板中央2 cm處，培養24 h。再在平板中央接種SH，25 ℃下靜置培養4 d，培養后測量病原菌菌落直徑，測量抑制率，并測量抑菌帶寬度。

1.6 共培養體系對立枯絲核菌的抑制作用

在系統研究木霉ZT05與促生細菌ZB155相互作用的前提下，探究在共培養體系條件下木霉ZT05與促生細菌ZB155對立枯絲核菌的抑制作用。

1.6.1 對峙培養對立枯絲核菌的抑制作用

分別設置單獨接種ZT05、ZB155及共接種ZT05和ZB155等3個接種處理，將培養好的ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）與ZT05孢子懸液（1.0×10⁶cfu·mL^-1）10 μL按照上述接種處理接種在距離PDA平板中心2.5 cm的一端，在另一端距接種點5.0 cm處接種病原菌SH菌餅。在28 ℃下靜置培養4 d，測量病原菌菌落直徑并計算抑制率。

1.6.2 發酵液對立枯絲核菌的抑制作用 按照K.Velmourougane的方法[23]，使用PD75∶NB25液體培養基（PD與NB比例為75∶25），提前接入10 μLZT05孢子懸液（1×10⁶cfu·mL-1），25 ℃震蕩培養，48h后接種10 μL ZB155菌液（1.0×10⁸cfu·mL^-1）振蕩培養48 h。培養后的發酵液過濾后以1 200 r·min^-1離心10 min獲取上清液，并經0.22 μm過濾膜過濾除菌，便得到ZT05與ZB155共培養體系的發酵液。

平板對峙：在PDA培養基中添加20%濃度的共培養發酵液，以不添加發酵液組為空白對照。平板中央接種SH，以不同濃度處理為對照組，在25 ℃下靜置培養至空白組菌絲長滿平板后，測量對照組菌落半徑并計算抑制率。

1.7 數據統計與分析

數據采用 Excel 2019 軟件進行初步處理，數據由平均值±標準誤（mean±SE）表示，每個指標設置 3 個重復。使用 SPSS19.0 統計學分析軟件對菌株生長、生物膜形成、抑制率進行單因素方差分析，使用 Origin 2019軟件處理數據并繪圖。

2 結果與分析

2.1 兼容性測定

5種木霉與促生細菌ZB155的體外共培養4 d后，測定不同處理木霉菌落直徑，計算抑制率。由表1和圖1可知，菌株ZT05的抑制率為4.67%，與菌株ZB155的兼容性最好，與其他4種木霉抑制率相比存在顯著性差異（P<0.05），木霉ZT05菌落與細菌ZB155的菌落之間沒有明顯抑制帶，且菌落接觸后可繞過細菌菌落繼續生長。

2.2 木霉與促生細菌的離體互作

2.2.1 ZB155發酵液對ZT05的影響

（1）對菌絲生長和孢子萌發的影響。ZB155發酵液代謝產物對ZT05菌落具有抑制作用。由圖2可以看出，菌株ZT05培養48 h時，不同濃度梯度之間ZT05生長存在顯著差異（P<0.05），但在培養96 h后，低濃度（1%～10%）之間差異減小，且均與空白對照無顯著差異，只在高濃度（20%～30%）處理下，存在顯著差異（P<0.05）。

結果表明菌株ZT05對ZB155發酵液代謝產物具有一定的適應性，但在高濃度條件下，ZB155發酵液代謝產物對ZT05的生長仍會產生抑制，抑制率為34.63%。

在孢子萌發方面，經過ZB155發酵液處理過的ZT05孢子在瓊脂平板上培養24 h后萌發率接近90%，因此，ZB155發酵液對ZT05孢子的萌發無抑制作用。

（2）拮抗作用。ZT05孢子經過1%～20%的ZB155發酵液處理6 h后，ZT05的拮抗活性并沒有出現顯著差異，其對立枯絲核菌的生長抑制率為68.96%～76.58%，見圖3。

其中當ZB155發酵液濃度為30%時，抑制率為66.81%，與空白組差異顯著（P<0.05），ZB155發酵液對ZT05的拮抗活性產生了抑制作用，見圖4。

2.2.2 ZT05發酵液對ZB155的影響BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

（1）對ZB155生長的影響。用不同濃度（1%～30%）的ZT05發酵液加入NB培養基后，ZB155產生了不同程度的增長，其中在濃度為20%時OD₆₃₀最大值為0.584 3，20%以后促進作用逐漸變緩，但較空白組仍有顯著差異（P<0.05）?？梢奪T05的發酵液對ZB155生長起到了促進作用，且這個作用在前期會隨著濃度增加而增加，在濃度為20%時達到最高，見圖5。

（2）對ZB155生物膜的影響。

ZT05發酵液的添加對ZB155細菌生物膜的形成具有抑制作用，培養48 h后，1%～30% ZT05發酵液添加濃度處理，生物膜OD₅₅₀值為0.282 7～0.312 1。同對照處理OD₅₅₀值0.315 6相比，低濃度（1%～20%）時無顯著差異，高濃度（30%）時差異顯著（P<0.05），見圖6。

（3）對ZB155拮抗活性的影響。

不同ZT05發酵液濃度梯度處理后，菌株ZB155對立枯絲核菌的抑制作用無顯著性差異，對SH的抑制率為68.52%～71.06%（圖7）。通過觀察抑菌帶也可發現，寬度均為0.25 cm左右，沒有明顯差異（圖8）。說明ZT05發酵液對ZB155的拮抗活性沒有影響。

2.2.3 共培養體系對立枯絲核菌的抑制作用

（1）對峙培養對立枯絲核菌的抑制作用。和單獨對峙培養相比，活體共培養可顯著提高對立枯絲核菌生長的抑制作用，其中單獨接種ZT05菌落對峙的抑制率為28.57%，單獨接種ZB155菌落對峙時的抑制率為14.29%，ZT+ZB處理組的抑制率為38.10%，均形成顯著差異（P<0.05），見圖9。

（2）發酵液對立枯絲核菌的抑制作用。

由圖10可看出，ZT05與ZB155液體共培養發酵液（20%添加濃度）可顯著提高對立枯絲核菌生長的抑制作用，抑制率為76.67%，與其他兩組單獨培養發酵液處理相比，差異顯著（P<0.05）

3 討論

3.1 兼容性分析

良好的菌株兼容性對成功建立木霉與促生細菌共培養體系至關重要，可起到協同增效的作用，否則由于菌種之間的相互競爭與抑制作用，會導致共培養體系生防水平的下降。

本試驗采用對峙培養法，根據抑菌圈大小、菌落直徑變化程度和菌落形態有無變化等[24]，初步了解對峙效果后，通過計算抑制率進行優良兼容性木霉菌株的篩選。經計算，菌株ZT05與菌株ZB155的兼容性最好，但抑制率僅為4.67%，顯著低于其余4個木霉菌株。對峙培養條件下，木霉菌株ZT05可以在細菌菌落周圍正常生長，隨著培養時間增加，木霉與細菌之間抑菌帶不明顯，甚至覆蓋細菌菌落，其他木霉菌株不僅會形成明顯抑菌帶，而且生長受到抑制，并且隨著對峙培養時間增加，生長逐漸停滯。因此，在兼容性分析中篩選出具有共培養可能性的ZT05+ZB155組合，為進一步研究互作機制打下良好基礎。

3.2 木霉與促生細菌的離體互作研究

本部分進行了促生細菌ZB155的發酵液與木霉ZT05發酵液對對方在生長及生防作用能力影響上的離體互作研究。因為微生物生防制劑的成功在很大程度上取決于引入的微生物主動在目標定殖的能力[25]，比如根際促生細菌（PGPR）生物膜的形成就與根部定殖有關。PGPR在根系分泌物濃度較高的地方形成微菌落或生物膜。在這些生物膜中，細菌之間相互溝通，以協調一致的方式發揮作用，并與抗性的誘導有關[26]。所以，除了通過與病原菌立枯絲核菌進行對峙培養以外，還對木霉ZT05的分生孢子萌發率及促生細菌ZB155的生物膜形成情況也進行了分析。

菌株ZB155發酵液對ZT05的生長和對立枯絲核菌的拮抗能力產生了抑制作用，但并沒有影響孢子萌發率。ZB155對ZT05的抑制效果與添加發酵液的濃度有關，在高濃度處理（20%～30%）中產生顯著的抑制作用，而在的低濃度處理（1%～10%）中，抑制作用不顯著。對峙培養中，經高濃度ZB155發酵液處理的木霉ZT05菌株對立枯絲核菌的抑制率下降，與低濃度及空白處理產生顯著差異（P<0.05），其原因也與ZT05的生長有關。經發酵液處理的ZT05菌落較稀疏，明顯是受到了生長方面的抑制作用，而木霉主要的拮抗作用便來自于競爭和寄生作用，當ZT05本身的生長受到抑制時，其對病原菌的抑制效果也會受到影響。

菌株ZT05發酵液對ZB155的生長具有促進作用，對病原菌的拮抗作用無影響。木霉ZT05發酵液胞外代謝產物低濃度處理（1%～20%）后，促生細菌ZB155生物膜形成同對照相比無顯著差異（P>0.05），在對峙培養中，菌株ZB155對病原菌的拮抗作用并未受到影響。

綜合分析，菌株ZT05和ZB155的互作中，以相互促進為主，只在高濃度處理中才表現出抑制作用，考慮到木霉的抗菌化合物在自然條件下的濃度遠低于本研究使用的濃度[27]，因此上述結果可以為接下來的活體共培養體系的建立打下基礎。

3.3 共培養體系的立枯絲核菌的抑制作用

共培養（co-culture）是在一個培養容器中一起培養兩種或多種微生物的方法。共培養可以在液體或固體培養基中進行。當使用液體培養時，該方法也稱為 “混合發酵”[28]。共培養體系與之前離體互作的區別在于，離體的互作更多是探究菌物之間胞外代謝產物的相互影響，并且從空間上講，兩者是分開獨自培養在自己的最適環境中。然而共培養體系會更加復雜，因為共培養體系的成功不僅取決于生防菌的個體能力，還取決于它們之間的相互作用[29]。

實驗結果表明，當木霉ZT05與促生細菌ZB155活體共培養時對立枯絲核菌SH的拮抗活性增強，其中共培養體系發酵液對立枯絲核菌的抑制效果顯著?；铙w共培養時，ZT+ZB處理與ZT或ZB單獨處理組對比時，抑制率均有顯著提高（P<0.5）?？梢钥闯?，ZT05在加入ZB155共培養后ZB155對其生長產生一定抑制，導致其菌落明顯比單獨接種時稀疏，菌落直徑減小，但抑制率卻不降反升。原因是ZB155雖減少了ZT05與SH的營養競爭能力，但自身也分泌了更多的胞外代謝產物，產生拮抗性，這兩方面因素均發生作用。從結果看，促進的作用要強于抑制的作用，這在后來的發酵液培養中也得到了證明。木霉活體抑制率較高，而發酵液抑制率較低，因為其主要的拮抗作用還是來自于活體的營養競爭。相反，促生細菌ZB155發酵液抑制率相比活體抑制率較高，是因為其主要靠胞外代謝產物產生抑菌作用。所以將ZT與ZB在適當的濃度比例共培養后，無論是活體對峙培養還是發酵液對峙培養，都比單獨接種有更高的抑制率。這也證明，在共培養體系的條件下，的確是達到了“1+1>1”的效果，但是否是“1+1>2”，還需要更加深入的研究。BE1FEC4D-3F78-488F-BF11-328AC6895654

為了更好地了解這些微生物在根際的相容性，還需要進一步的接種試驗，并且在共培養體系的構建上需要進一步優化培養基組合、溫度、共培養方式等，以求兩種菌之間最大的兼容性。但至少在本次試驗中，我們見證了構建共培養體系的優勢。

4 結論

4.1 比較T43、T101、ZT05、T14、5436這5株木霉菌株，ZT05是與促生細菌ZB155具有最佳兼容性的，可用于構建共培養體系。

4.2 在離體互作中，木霉ZT05與促生細菌ZB155之間并沒有展現出明顯的抑制作用，尤其是在生防作用方面。

4.3 木霉ZT05與促生細菌ZB155的共培養體系在對立枯絲核菌的拮抗作用研究中展現出了較好的作用，相比于單獨培養，共培養體系的拮抗作用有明顯的增強，尤其在發酵液的對峙中，促進作用明顯。這證明了多種菌株共培養體系的建立是有利的。

4.4 本次離體共培養體系的建立展現了其優越性及潛力，在生防作用上，為以后的接種試驗打下基礎。

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