HK-2外泌體提取及體外細胞靶向性的研究

譚小寧 李勇敏 馬榮麗 羅吉 呂元

〔摘要〕 目的 比較HK-2外泌體分離方法對粒徑分布的影響，探索體外細胞攝取外泌體模式對外泌體細胞靶向性的參考價值。方法 采用超速離心法和3種試劑盒分離HK-2外泌體，測定其粒徑分布;用PKH67標記HK-2外泌體，體外觀察HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116 4種細胞吸收HK-2外泌體，以及HCT116吸收HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer 4種細胞的外泌體情況。結果 不同的分離方法得到外泌體的粒徑分析結果顯示，超速離心法得到外膜囊泡的粒徑比較均一，集中在100 nm左右。體外細胞吸收外泌體試驗結果顯示：（1）在體外，HK-2外泌體均能被HFL1、hFOB1.19、 Kupffer、HCT116細胞吸收;（2）HCT116能吸收HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer細胞的外泌體。結論 超速離心法和試劑盒都能分離得到HK-2外泌體，超速離心法得到外泌體粒徑大小分布較均一;試劑盒操作比較便捷，但是大囊泡和雜蛋白居多。在體外，同種外泌體能被多種細胞攝取吸收，同種細胞能吸收不同種細胞外泌體，表明外泌體在體外沒有特別好的靶向性。

〔關鍵詞〕 外泌體;超速離心法;粒徑分布;體外細胞;靶向吸收

〔中圖分類號〕R2 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.009

Extraction of HK-2 exosomes and cell targeting in vitro

TAN Xiaoning1， LI Yongmin1*， MA Rongli2， LUO Ji1， LV Yuan1

（1. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Changsha， Hunan 410006， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To compare the effect of HK-2 exosomes separation method on particle size distribution， and to explore the reference value of model of exosome uptake by cells in vitro for exosome targeting. Methods HK-2 exosomes were separated by supercentrifugation and three kits， and its particle size distribution was determined. HK-2 exosomes were labeled with PKH67 to observe the absorption by HFL1， hFOB1.19， Kupffer and HCT116 cells， and exosomes of HCT116， HK-2， HFL1 and Kupffer cells were absorbed by HCT116. Results The particle size analysis of exosomes obtained by different separation methods showed that the particle size of outer membrane vesicles obtained by supercentrifugation was relatively uniform， concentrated at about 100 nm. The results of in vitro cell absorption of exosomes showed that： （1） HFL1， hFOB1.19， Kupffer and HCT116 cells could absorb HK-2 exosomes in vitro. （2） HCT116 can absorb exosomes of HCT116， HK-2， HFL1 and Kupffer cells. Conclusion HK-2 exosomes can be isolated by supercentrifugation and kit. The particle size distribution of the exosomes obtained by supercentrifugation method is relatively uniform. The kit is relatively easy to operate， but large vesicles and miscellaneous proteins are in the majority. In vitro， the same exosomes can be absorbed by multiple cells， and the same cells can absorb different kinds of exosomes， indicating that there is no particularly good targeting.

〔Keywords〕 exosome; supercentrifugation; size distribution; in vitro cells; targeted absorptionF80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

外泌體（exosome， Exo）是一類直徑30～120 nm的有被囊性小泡，成杯狀或球形結構，表面富含膽固醇、神經鞘磷脂、神經酰胺等脂類物質[1-2]。外泌體在形成過程中選擇性地包裹細胞質中的一些蛋白質、核酸等信息物質，參與細胞通信、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程，在生物信息交流中起關鍵作用[3-5]。本課題組一直關注外泌體與臟腑相關理論之聯系，以細胞外泌體的特性來探索腎與骨之間的通信交流[6-7]。外泌體的研究越來越多，但是外泌體的分離純化方法以及靶向細胞的尋找，一直困擾著研究者。本文比較超速離心法和3種常用的商業化試劑盒分離對人腎近曲小管上皮細胞HK-2外泌體的粒徑分布的影響，并通過比較同種外泌體被多種細胞攝取吸收，同種細胞吸收不同種細胞外泌體的情況，獲得體外細胞攝取外泌體方式對外泌體尋找靶向細胞的評估價值，望能促進外泌體的研究。

1 材料

1.1 ?細胞

人腎近曲小管上皮細胞（HK-2）（目錄號SCSP-511）、人SV40轉染成骨細胞（hFOB1.19）（目錄號GNHu14）、人結腸癌細胞（HCT116）（目錄號TCHu 99），均購自中國科學院細胞庫;肝臟巨噬細胞（Kupffer）（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CP-R132）;人肺成纖維細胞（HFL1）由中南大學生命科學院贈送。

1.2 ?主要試劑

DMEM/F-12粉末（批號：1881051）、ES級胎牛血清（批號：1809582）均購自美國Gibco公司;無外泌體胎牛血清（上海素爾生物有限公司，批號：SUER050QY）;exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒（德國QIAGEN公司，貨號：76064）;ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒（美國SBI公司，貨號：EXOTC10A-1）;GETTM外泌體分離純化試劑盒（北京捷騰生物科技有限公司，貨號：GET300-2）;一抗稀釋液（貨號：P0023A）、封閉液（貨號：P0252）、超敏發光液（貨號：P0018）、DAPI染色液（貨號：C1002）均購自上海碧云天公司;PKH67熒光試劑盒（美國Sigma公司，批號：MKBZ0604V）;F-Actin染色試劑盒（美國Abnova公司，批號：1631293）。

1.3 ?主要儀器

超速離心機（美國Bechman公司，型號：L-100XP）;納米顆粒跟蹤分析儀（德國Particle Metrix公司，型號：ZetaView）;電泳儀（美國Hoefer公司，型號：SE300）;正置熒光顯微鏡（型號：DM4000型）、激光共聚焦顯微鏡（型號：TCS-SPS）均購自德國Leica公司;超高分辨率成像系統（美國Applied Precision公司，型號：DeltaVision OMX Blaze）。

2 方法

2.1 ?細胞培養及上清液收集

人腎近曲小管上皮細胞（HK-2）培養于10% FBS的DMEM/F-12完全培養基中，37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養箱中培養。匯合率達80%左右時，0.25%胰酶消化細胞成單個細胞懸液，1∶2進行傳代培養。于提取外泌體之前更換成含10%無外泌體的FBS的DMEM/F-12培養基培養。48 h后，收集上清液，300×g離心10 min去除殘留的細胞，2000×g離心10 min去除死細胞，10 000×g離心30 min去除大的囊泡和凋亡小體，得到比較純的HK-2上清液。用超濾管對HK-2上清液進行濃縮，4000×g離心25 min，大約濃縮10倍。

2.2 ?分離純化HK-2外泌體

2.2.1 ?超速離心法提取HK-2外泌體 ?超速離心管滅菌，每支裝約20 mL的預處理濃縮后的HK-2上清液，于超高速離心機100 000×g離心70 min，小心吸出上清液，留1 mL液體;再加19 mL PBS洗外泌體，100 000×g離心70 min去掉雜蛋白，吸出上清液，用適量的PBS重懸。

2.2.2 ?exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒提取HK-2外泌體 ?預處理濃縮后的HK-2細胞培養上清液8 mL，加入與上清液等體積的緩沖液Buffer XBP，混勻加到離心柱里，500×g離心1 min，去掉膜下面的液體，把膜親和離心柱轉移到新的收集管中。用10 mL緩沖液Buffer XWP清洗離心柱上結合的外泌體，5000×g離心5 min去除殘留的緩沖液。將離心柱轉移到新的收集管中，加入400 μL的緩沖液Buffer XE和膜孵育1 min，500×g離心5 min進行洗脫，收集洗脫液。再把洗脫液加到離心柱的膜上，孵育1 min，5000×g離心5 min，收集洗脫液。

2.2.3 ?ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒分離純化HK-2外泌體 ?沉淀溶液和樣品的比例為1∶5，在5 mL預處理濃縮后的HK-2上清液中加入1 mL沉淀溶液混勻，4 ℃冰箱內放置過夜，1500×g離心30 min，吸出上清液，加入100～500 μL PBS重懸即可。

2.2.4 ?GETTM外泌體分離純化試劑盒分離純化HK-2外泌體 ?濾器預處理：把GETTM過濾器安裝在50 mL的離心管上，在膜上均勻加500 μL的預處理液，抽真空使液體完全通過濾器。再均勻地加200 μL平衡液至濾膜上，抽真空使完全通過濾器。上樣：加50 mL HK-2上清液（未濃縮），抽真空使上清液完全通過濾膜，可一次性處理250 mL。洗滌：均勻地加100 μL 洗滌液至濾膜上，抽真空使液體完全通過濾器。收集外泌體：把GETTM過濾器轉移到新的50 mL的離心管上，在濾膜上加400 μL收集液，與濾膜孵育2 min，使液體完全通過濾膜，收集管中的外泌體懸液。F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

2.3 ?粒徑分析

將4種方法分離得到的外泌體每個取10 μL稀釋500倍，用納米顆粒跟蹤分析儀測定外泌體的粒徑分布及濃度。

2.4 ?HK-2外泌體體外靶向成骨細胞（hFOB1.19）檢測

通過HK-2外泌體提取方法的比較，4種方法中選擇超速離心法制備外泌體進行后續靶向實驗研究。PKH67標記外泌體后加入hFOB1.19中：取外泌體懸液200 μL，加入1 mL 稀釋液;另取離心管，加入1 mL稀釋液，再加入4 μL PKH67染料溶液混合均勻;把外泌體懸液加到染料中，室溫孵育2 min;加入2 mL無外泌體血清孵育1 min終止染色;100 000×g離心70 min收集外泌體，用PBS洗滌，再超速離心，用200 μL PBS懸浮避光保存。hFOB1.19匯合率達到80%時，用胰酶消化，細胞計數。在6孔板里預先加入蓋玻片，將hFOB1.19以每孔2×105/mL的濃度接種在玻片上，置于33.5 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。待細胞貼壁后，加入PKH67標記的外泌體，每孔加50 μL，培養3 h。

2.4.1 ?激光共聚焦顯微鏡觀察 ?將加入外泌體孵育3 h的6孔板移出培養箱，吸除上清液，用PBS洗一遍，加入1 mL 4%多聚甲醛固定20 min，吸出固定液，用PBS洗3遍。加入1 μg/mL的DAPI染色液1 mL，避光孵育20 min，吸出染色液，用PBS洗去多余的染料。在載玻片上滴一滴甘油，把蓋玻片從6孔板里拿出放在載玻片上，放4 ℃冰箱內避光保存，采用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2.4.2 ?超高分辨率成像系統觀察 ?按照“2.4.1”操作，制備DAPI染色細胞爬片，用肌動蛋白染色試劑盒標記細胞骨架。取1 μL染料加到1 mL的緩沖液Labeling Buffer中稀釋，取500 μL加入激光共聚焦小皿中，室溫避光孵育30 min，用PBS洗去多余的染料，用超高分辨率成像系統觀察并拍照。

2.5 ?HK-2外泌體體外攝取情況觀察

選擇HFL1、Kupffer、HCT116、hFOB1.19細胞（這些細胞來源于肺、肝、腸、骨等不同組織，且為本實驗室保存）為觀察對象。同“2.4”操作，培養細胞，制備好細胞爬片，分四象限排放于培養皿中，加入PKH67標記的HK-2外泌體200 μL，室溫避光孵育3 h，用PBS洗去多余的染料，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 ?HCT116體外攝取多種細胞外泌體觀察

按照“2.4”操作，分別制備HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer細胞外泌體并用PKH67標記，分別加入HCT116細胞中，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

3 結果

3.1 ?HK-2外泌體不同提取方法對粒徑分布的影響

超速離心HK-2上清液得到外泌體，粒徑集中在100 nm左右，表明外泌體粒徑均一，純度較高，1 mL HK-2上清液可以分離得到1.2×108個外囊泡（圖1）;exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒、ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒、GETTM外泌體分離純化試劑盒提取HK-2上清液的外泌體大部分粒徑集中在100～500 nm，大囊泡居多。exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒、ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒、GETTM外泌體分離純化試劑盒提取的外泌體濃度分別為9.4×106/mL（圖2）、6.6×107/mL（圖3）、8.7×107/mL（圖4）。

3.2 ?激光共聚焦顯微鏡觀察HK-2外泌體體外靶向成骨細胞（hFOB1.19）

激光共聚焦顯微鏡觀察如圖5，可見HK-2 外泌體被hFOB1.19攝取并分布在核周圍。

3.3 ?超高分辨率成像系統觀察HK-2外泌體體外靶向hFOB1.19

圖6A為超高分辨率成像系統下F-Actin紅色熒光標記細胞骨架、DAPI藍色熒光標記細胞核的hFOB1.19細胞。圖6B可以清晰地觀察到PKH67標記的HK-2外泌體已進入hFOB1.19細胞，分布在細胞核周圍。將圖6B視野旋轉90°后為圖6C所示，旋轉180°為圖6D所示，從不同角度可見，在hFOB1.19細胞核中間可見綠色的HK-2外泌體顆粒，確定HK-2外泌體已被hFOB1.19攝入細胞中。

3.4 ?熒光顯微鏡觀察HK-2外泌體體外被多種細胞攝取情況

HK-2外泌體加入HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116細胞中檢測，如圖7所示，可見細胞內有PKH67標記的綠色外泌體，說明HK-2外泌體能被HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116細胞攝取。本研究中PKH67標記的HK-2外泌體的熒光信號容易淬滅，且細胞周圍的HK-2外泌體熒光信號聚集過多，難以區別細胞對外泌體攝取量的差異。

3.5 ?熒光顯微鏡下觀察HCT116體外攝取多種細胞外泌體情況

HFL1、HK-2、Kupffer、HCT116的外泌體加入HCT116細胞中，熒光顯微鏡下能看到HCT116細胞內出現PKH67標記的外泌體，如圖8，說明HFL1、HK-2、Kupffer、HCT116的外泌體在體外均能被HCT116所攝取。

4 討論

外泌體具有源細胞特征、器官靶向性與生物功能性三大特性，從外泌體角度對臟腑相關理論進行闡釋，視外泌體為臟腑之間的一個靶向信使，由各臟腑細胞分泌，沿著臟腑相關的路線，靶向目標，調控靶器官功能，且運用臟腑相關理論有可能預測外泌體的靶向運動和生物功能。這對于中醫基礎理論的研究具有重要意義。F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

細胞在胞外環境的刺激下會發生內吞、出芽，形成內囊泡，同時選擇性地包裹細胞質中的蛋白質、核酸等，與細胞膜融合后形成外泌體被釋放到胞外[8]。外泌體提取分離的常用方法是超速離心法，但其耗時比較長，極高的轉速可能破壞囊泡的結構。試劑盒操作簡便、耗時短，但聚合物沉淀引入過多雜蛋白，導致外泌體蛋白定量不準確。另外，在提取外泌體的過程中，一些化學試劑的加入破壞了囊泡的生物功能，導致外泌體功能研究難以進行[9-10]。本研究用超速離心法和3種常用的試劑盒分別提取HK-2外泌體，發現超速離心法提取外泌體粒徑分布集中在100 nm左右，均一性好，質量好。試劑盒提取外泌體的共性是100 nm以上的囊泡居多，exoEasy Maxi外泌體分離提取試劑盒提取的外泌體濃度低，粒徑分布集中，質量較好，ExoQuick-TCTM、GETTM提取的外泌體粒徑分布有2個峰，均一性較差。

研究中還有一些其他的提取外泌體的方法，凝膠尺寸排阻色譜是依靠細胞外囊泡的直徑與其他成分進行區分，但是在一些樣品（如血漿）中存在大量與囊泡尺寸相似的粒子（如脂蛋白）等，因此分離效果不是很理想;免疫親和純化是僅選擇一種外泌體亞型通過外泌體表面蛋白的親和方式來捕獲外泌體，該方法受限于抗體的特異性等問題，樣品也會存在很多雜質。在研究中可以用兩種方法同時用于外泌體的分離，SHARMA等[11]使用離心、浮力密度和超濾方法組合的手段從細胞條件培養基和生物流體中分離外泌體。近年來已經開發出一些用于快速分離和分析外泌體的裝置，如微流控芯片、交流電動力學微陣列芯片裝置主要用于血液中外泌體的分析，不需要預處理或稀釋樣品，也不需要使用捕獲抗體或其他親和技術，可以在30 min內對靶標進行特異性鑒定和定量，實現無縫的“樣本到答案”的液體活檢篩查[12]。

細胞外泌體分離純化至關重要，最新的研究發現不同尺寸的外泌體的發生機制和功能作用不同[13]，ZHANG等[14]用不對稱流場分離技術對細胞釋放的納米級顆粒進行分類，證實了外泌體亞類的存在，把直徑為90～120 nm的外泌體囊泡稱為大外泌體囊泡，60～80 nm的稱為小外泌體囊泡，把直徑大約35 nm的稱為“外泌顆?！?，深入分析之后發現這3種納米顆粒顯示出不同的蛋白質組、脂質、RNA和DNA分布以及N-糖基化模式，表明它們可能來源于不同的生物發生機制。因此，對外泌體的分離方法的優化仍是需要繼續研究的課題。

細胞外泌體屬納米級，無色透明，即使超高分辨率顯微鏡（目前的STED技術分辨率可達30 nm）[15]也難以清楚分辨。因囊泡膜標記較方便，綠色熒光染料PKH67及橙紅色熒光染料PKH26、Di1等標記技術成熟[16-17]，因此，觀察細胞外泌體以熒光標記囊泡膜為主。然而這種膜標記熒光信號弱，難以在活體動物上清晰捕捉。近期，RIDDER等[18]用逆轉錄病毒載體轉染小鼠腫瘤細胞TU2449，使其表達Cre重組酶，該腫瘤細胞的外泌體攜帶Cre-mRNA，將腫瘤細胞或其外囊泡注入含有Rosa26-stop-Rep報告基因的克隆小鼠中，當外泌體被靶細胞吸收，釋放Cre- mRNA，剪斷stop編碼，Rep基因顯性呈紅色，表明外泌體到達該細胞組織，形成良好的外泌體體內運行可視系統。在此基礎上，BITTEL等[19]利用Cre-LoxP系統報告，在Rosa26-tdTomato-reporter背景下，發現大腸埃希菌外膜囊泡在體內的轉移路線，cre-OMV轉移到腸上皮細胞，包括腸干細胞和巨噬細胞，此外，心臟、肝臟、腎臟、脾臟和大腦也有出現。細胞和細菌外囊泡體內轉移信息可視化系統的研制，大大促進了囊泡生物信息科學的研究進程。

細胞外泌體靶向性或選擇性是囊泡研究的另一焦點。本課題組發現，在體外，HK-2外泌體能被不同細胞攝取，同時，人結腸癌細胞HCT116可吸收不同細胞的外泌體，用熒光顯微鏡甚至激光共聚焦觀察難以判斷其靶向性或選擇性。TENG等[20]用PKH26標記植物來源的外泌體，與多種細胞體外共培養，再用流式細胞儀測定紅色熒光強弱，以此判斷外泌體對細胞的選擇性;然后采用Dil標記外泌體，觀察其在體內的分布，結合體外實驗判斷植物來源的外泌體對體內細胞的選擇性，既簡單又有很好的準確性，值得借鑒。

本研究探討了外泌體被體外細胞攝取的情況，對于外泌體在體內的實際分布與靶向性情況如何，有待進一步研究。

參考文獻

[1] BROWN T J， JAMES V. The role of extracellular vesicles in the development of a cancer stem cell microenvironment niche and potential therapeutic targets： A systematic review[J]. Cancers， 2021， 13（10）： 2435.

[2] REYES-RUIZ J M， OSUNA-RAMOS J F， DE JES[U][']S-GONZ?LEZ L A， et al. The regulation of Flavivirus infection by hijacking exosome-mediated cell-cell communication： New insights on virus-host interactions[J]. Viruses， 2020， 12（7）： E765.

[3] DENG Y， SUN Z， WANG L， et al. Biosensor-based assay of exosome biomarker for early diagnosis of cancer[J]. Frontiers of Medicine， 2022， 16（2）：157-175.F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

[4] GONZ?LEZ-SARR?AS A， IGLESIAS-AGUIRRE C E， CORT?S-MARTíN A， et al. Milk-derived exosomes as nanocarriers to deliver curcumin and resveratrol in breast tissue and enhance their anticancer activity[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（5）： 2860.

[5] 付佳琪，蔡治國，于漫亞，等.基于網絡藥理學及全轉錄組測序對當歸四逆湯干預外泌體抑制多發性骨髓瘤血管新生的機制研究[J]. 湖南中醫藥大學學報，2022，42（1）：120-128.

[6] 李勇敏，譚小寧，馬榮麗，等.中醫臟腑相關理論新釋：外泌體與臟腑相關理論之聯系探微[J].湖南中醫雜志，2017，33（2）：1-4.

[7] 馬榮麗，李勇敏，譚小寧，等.腎細胞外泌體的研究進展[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1291-1294.

[8] KALLURI R， LEBLEU V S. The biology， function， and biomedical applications of exosomes[J]. Science， 2020， 367（6478）： 1-15.

[9] DU K L， SUN X D， TANG X H， et al. Effects of storage temperature and time on quality of plasma exosomes extracted by ExoQuickTM and Umibio kits[J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology， 2020， 36（4）： 330-336.

[10] LUO D， LI C L， WU L， et al. Advances of exosomes extraction and its mechanism in early diagnosis of lung cancer[J]. Chinese Journal of Lung Cancer， 2020， 23（11）： 999-1006.

[11] SHARMA S， SCHOLZ-ROMERO K， RICE G E， et al. Methods to enrich exosomes from conditioned media and biological fluids[J]. Methods in Molecular Biology， 2018， 1710： 103-115.

[12] LEWIS J M， VYAS A D， QIU Y Q， et al. Integrated analysis of exosomal protein biomarkers on alternating current electrokinetic chips enables rapid detection of pancreatic cancer in patient blood[J]. ACS Nano， 2018， 12（4）： 3311-3320.

[13] CHEN J C， LI P L， ZHANG T Y， et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology， 2021（9）：1-18.

[14] ZHANG H， FREITAS D， KIM H S， et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation[J]. Nature Cell Biology， 2018， 20（3）： 332-343.

[15] SZATANEK R， BAJ-KRZYWORZEKA M， ZIMOCH J， et al. The methods of choice for extracellular vesicles （EVs） characterization[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18（6）： 1153.

[16] LI B Z， XU H X， HAN H Y， et al. Exosome-mediated transfer of lncRUNX2-AS1 from multiple myeloma cells to MSCs contributes to osteogenesis[J]. Oncogene， 2018， 37（41）： 5508-5519.

[17] SHAN Y， YOU B， SHI S， et al. Hypoxia-induced matrix metalloproteinase-13 expression in exosomes from nasopharyngeal carcinoma enhances metastases[J]. Cell Death & Disease， 2018， 9（3）： 382.

[18] RIDDER K， SEVKO A， HEIDE J， et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of functional RNA in the tumor microenvironment[J]. Oncoimmunology， 2015， 4（6）： e1008371.

[19] BITTEL M， REICHERT P， SARFATI I， et al. Visualizing transfer of microbial biomolecules by outer membrane vesicles in microbe-host-communication in vivo[J]. Journal of Extracellular Vesicles， 2021， 10（12）： e12159.

[20] TENG Y， REN Y， SAYED M， et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota[J]. Cell Host & Microbe， 2018， 24（5）： 637-652.F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69