基于網絡藥理學探討桂枝茯苓丸治療腦水腫作用機制

區鳳娟 高芳瑜 余尚貞 張家明 劉曉林

[摘要]目的運用網絡藥理學方法探究桂枝茯苓丸治療腦水腫的潛在效應機制。方法利用TCMSP收集桂枝茯苓丸化學成分及其靶標基因。通過OMIM、GeneCards、Drug Bank等數據庫獲取腦水腫疾病靶標基因。將成分靶標、疾病靶標交集部分上傳至String數據庫，構建中藥成分靶標-疾病靶標蛋白互作網絡，并計算網絡特征值，篩選出關鍵靶標。借助Metascape分析平臺對關鍵靶標進行GO分析和KEGG通路富集分析。結果共獲取桂枝茯苓丸44個活性成分，作用靶標206個;桂枝茯苓丸治療腦水腫交集靶標128個，相互作用核心基因為AKT1、IL-6、VEGFA等，其主要作用通路為糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、癌癥相關通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等。結論桂枝茯苓丸治療腦水腫的效應機制可能與炎癥反應、抗氧化應激、穩定血腦屏障等相關。

[關鍵詞]桂枝茯苓丸;腦水腫;網絡藥理學;靶點;作用機制

[中圖分類號]R273

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）11-0018-05

腦水腫是指各種病因引起的腦內水分異常增加，導致腦容積增大的病理現象[1]。腦水腫可顯著提高顱內壓，如果不加以控制，高顱壓會壓迫周圍的腦組織，導致腦組織缺血、腦疝，甚至死亡[2]。目前臨床上常用的治療腦水腫的藥物為滲透性利尿劑甘露醇和高滲鹽水，這兩種藥物可暫時降低顱內壓，然而其可能導致急性腎功能衰竭、低血壓、溶血和充血性心力衰竭，還可能誘發顱內壓的反彈[3]。桂枝茯苓丸源自《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治》第二十篇：“婦人宿有癥病，經斷未及三月......當下其癥，桂枝茯苓丸主之?！痹摲接晒鹬?、牡丹皮、桃仁、芍藥以及茯苓5味藥物研末煉蜜和丸而成，具有活血利水、化瘀消癥的功效。桂枝茯苓丸用于治療婦科疾病已有數千年，現代研究也發現其可用于治療水腫性疾病，尤對于水瘀互結類疾病具有獨特療效，譬如糖尿病腎病性水腫、腦水腫、心源性水腫[4-6]。顱腦水瘀是腦水腫疾病進展中重要的病機[7]，桂枝茯苓丸具有活血利水之效，然而臨床上關于桂枝茯苓丸治療腦水腫的研究較少。由于腦水腫起病急、進展快，是造成高病死率[8]以及不良預后[9]的重要原因，然而目前并無顯著有效的藥物或手段治療腦水腫，因此，探究桂枝茯苓丸治療腦水腫多靶點、多通路的效應機制具有積極意義。

網絡藥理學是通過“藥物-靶標-基因-疾病”相互作用網絡，探索藥物與疾病之間的關系的分析方法[10]。本研究擬運用網絡藥理學分析方法，從多層次揭示桂枝茯苓丸治療腦水腫的潛在效應機制，為其進一步藥理作用研究和臨床應用提供依據。

1資料與方法

1.1藥物活性成分及靶點收集

以桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮5味中藥為關鍵詞，使用TCMSP平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）查詢上述藥物的所有成分，然后根據ADME參數（OB≥30%、DL≥0.18）篩選出可能的活性藥物小分子。將篩選的藥物活性成分引入TCMSP、DrugBank[11]（https：//go.drugbank.com/）預測其靶點，再將上述獲得的藥物作用靶點輸入Uniprot[12]數據庫中查詢靶點蛋白對應的基因簡稱，剔除非人源靶點后得到藥物候選靶點。

1.2腦水腫靶標收集

本研究以cerebral edema、brain edema作為腦水腫的關鍵詞，通過檢索Drug Bank、OMIM[13]（https：//omim.org/）、GeneCards[14]（https：//www.

genecards.org/）數據庫構建腦水腫靶標數據庫。

1.3蛋白互作網絡（PPI）構建與分析

將桂枝茯苓丸預測靶標及腦水腫疾病靶標上傳至Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線分析工具，獲取兩者共同靶標，繪制Venny圖。將桂枝茯苓丸成分靶標、腦水腫疾病靶標交集部分導入String[15]數據庫，構建中藥成分靶標-疾病靶標PPI網絡。使用Cytoscape3.8.2軟件分析其網絡拓撲特征值，進行可視化處理。

1.4基因功能及通路富集分析

將篩選后的靶點導入Metascape平臺進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析[16]及KEGG通路富集分析[17]，保存其結果并以圖表形式展示。

2結果

2.1桂枝茯苓丸活性成分及靶點獲取

通過TCMSP數據庫收集到5味藥物44個活性成分，包括山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、鞣花酸（ellagic acid）、芍藥苷元（paeoniflorgenone）、芍藥苷（paeoniflorin）、baicalein（黃芩素）、Baicalin（黃芩苷）等成分。將44個藥物活性成分進行處理，最終得到5味藥物候選靶點206個。

2.2腦水腫靶標收集

檢索GeneCards、OMIM、DrugBank疾病數據庫，得到腦水腫靶點個數分別為8327、465、126個，篩選并去除重復值后得到靶點1978個。藥物靶點與疾病靶點交集為128個。見圖1。

2.3PPI網絡構建與分析

將桂枝茯苓丸治療腦水腫的候選靶標上傳至STRING數據庫，構建PPI網絡。計算網絡特征值共獲取關鍵靶標32個，關鍵靶標間相互作用關系454條。利用Cytoscape3.8.2軟件對腦水腫靶標相互作用網絡進行可視化處理。研究結果顯示，桂枝茯苓丸治療腦水腫的效應機制可能與AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、TP53、TNF、EGF、JUN、MAPK8、MAPK1、EGFR、PTGS2、MMP9等基因相關。見圖2。

2.4桂枝茯苓丸治療腦水腫基因功能分析結果

為進一步了解桂枝茯苓丸治療腦水腫關鍵靶標在生物體中發揮的作用，通過Metascape數據庫對128個關鍵靶標進行GO基因功能分析，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC）分析。根據-Log10（P）大小進行排序，選取前10個條目展示。見圖3。

2.5桂枝茯苓丸治療腦水腫通路富集分析結果

通過Metascape數據庫對桂枝茯苓丸治療腦水腫關鍵靶標進行KEGG通路富集分析，選取前10個條目展示。見圖4。

3討論

從上述結果可知，桂枝茯苓丸治療腦水腫的主要成分可能為山萘酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、槲皮素（quercetin）等?，F代藥理學研究發現山萘酚、β-谷固醇、槲皮素均具有免疫調節、抗炎等藥理作用[18-20]。槲皮素還能抑制凝血酶和凝血因子的活性[21]。而腦水腫形成過程與炎癥因子、凝血酶等具有相關性[22]。桂枝茯苓丸治療腦水腫的靶點相互作用網絡直觀體現了靶點間的相互作用，根據PPI結果，該網絡的核心靶點為AKT1、IL-6和VEGFA。AKT1可通過PI3K/AKT通路調控炎癥因子基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的合成或釋放，從而改變內皮細胞和血管通透性[23]，影響血腦屏障中緊密連接相關蛋白的功能[24]，加重腦水腫。IL-6作為常見的炎癥因子，可促進炎癥瀑布效應的形成[25]，IL-6的分泌可增加血腦屏障的通透性，擴大腦水腫[26]。VEGFA具有促進神經功能修復、誘導神經發育和血管生成的作用[27]，對于血腦屏障的完整性和內皮細胞的存活是必不可少的[28]。當VEGFA高表達時，可導致血管通透性增加，破壞血腦屏障功能，使中樞神經系統穩態失衡[29]。本研究結果表明，AKT1、IL-6和VEGFA均與腦水腫的形成以及進展相關，故桂枝茯苓丸可能以AKT1、IL-6和VEGFA為主要作用靶點，通過調節炎癥反應以及內皮細胞功能以改善腦水腫。

根據生物學過程（GOBP）、分子功能（GOMF）、細胞組分（GOCC）富集結果分析可見，桂枝茯苓丸治療腦水腫的機制可能與對無機物的反應、活性氧代謝過程、炎癥反應、凋亡信號通路、血管發育、蛋白質結構域特異性結合、細胞因子受體結合、蛋白酶結合過程、脂筏、樹突等密切相關?，F代醫學認為，腦水腫過程涉及血腦屏障結構功能的損害和腦細胞能量代謝的障礙，其中包括細胞毒性水腫、離子水腫以及血管源性水腫[30]。細胞毒性水腫和離子水腫的形成涉及多種離子通道和轉運體，包括磺酰脲類受體-1-瞬時受體電位離子通道蛋白4（SUR-1-TRPM4）、鈉鉀氯共轉運體1（NKCC1）、鈉氫交換器（NHE）、興奮性氨基酸轉運體（EAATs）和水通道蛋白[31-33]。多種因子包括MMPs、P物質、血管內皮生長因子（VEGF）、凝血酶和促炎細胞因子（如腫瘤壞死因子、IL-6和IL-1β）促進血管源性水腫的發生[34-36]。在上述腦水腫的過程中可發現其包含了無機物的反應、活性氧代謝過程、炎癥反應、凋亡信號通路的生物學過程，涉及了血管發育、蛋白質結構域特異性結合、細胞因子受體結合、蛋白酶結合等分子功能，利用了脂筏、樹突等結構，與GO分析結果相符。

根據KEGG通路富集分析結果顯示桂枝茯苓丸治療腦水腫的主要效應通路為AGE-RAGE、IL-17、PI3K-Akt等多條信號通路。在AGE-RAGE信號通路中，RAGE在炎癥反應中起促炎性遞質的作用[37]。AGEs是RAGE的重要配體，AGEs可作用于其受體RAGE，從而激活小膠質細胞（MG），誘導其釋放IL-1β和TNF-α。IL-1β既可上調星形膠質細胞或MG表達其他細胞因子，還可使一氧化氮、前列腺素、補體、氧自由基、β-淀粉樣前體蛋白等物質生成增加，引起中樞神經系統損傷[38]。AGEs還可激活活性氧簇相關的轉錄因子NF-κB等，進而引發炎癥和氧化應激反應，導致炎癥因子高表達，損害大腦皮質神經元的結構及功能[39]。根據KEGG通路富集最顯著的AGE-RAGE信號通路推斷，桂枝茯苓丸治療腦水腫機制可能與抗氧化、抑制炎癥反應相關。

腦水腫發病機制較為復雜，而目前尚無關于桂枝茯苓丸治療腦水腫的有效成分、靶點和機制的報道。根據網絡藥理學結果綜合分析，桂枝茯苓丸治療腦水腫的機制主要涉及炎癥反應、抗氧化應激、穩定血腦屏障等。目前多數基于網絡藥理學的研究仍在靜態網絡分析中，然而人體功能是一個連續的動態過程。因此，桂枝茯苓丸治療腦水腫的活性成分、有效途徑等仍需進一步的實驗驗證。

[參考文獻]

[1] JCook Aaron M，Morgan Jones G，Hawryluk Gregory WJ，et al.Guidelines for the Acute Treatment of Cerebral Edema in Neurocritical Care Patients[J].Neurocritical Care，2020，32（3）：647-666.

[2] Halstead Michael R，Geocadin Romergryko G.The Medical Management of Cerebral Edema： Past， Present， and Future Therapies[J].Neurotherapeutics： the Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics，2019，16 （4）：1133-1148.

[4]李露，賀小蘭.桂枝茯苓丸聯合真武湯治療糖尿病腎病性水腫的臨床觀察[J].內蒙古中醫藥，2020，39（1）：22-23.

[5]李彥杰，盧永保，李斯錦.桂枝茯苓丸在異病同治中的應用[J].中醫臨床研究，2019，11（16）：99-101.

[6]王亞方，鄭愛華.桂枝茯苓丸合芩桂術甘湯治療慢性心力衰竭急性發作臨床觀察[J].中國中醫藥現代遠程教育，2021，19（3）：103-105.

[7]周子懿，王立新，黃培新.腦水腫的中醫證治探討[J].中華中醫藥雜志，2020，35（2）：760-763.

[8] Antonio Muscari，Luca Faccioli，Maria Vittoria Lega，et al. Predicting cerebral edema in ischemic stroke patients[J]. Springer International Publishing，2019，40（4）： 745-752.

[9] Matthew A.Koenig.Cerebral Edema and Elevated Intracranial Pressure[J].CONTINUUM：Lifelong Learning in Neurology，2018，24（6）：1588-1602.

[10]潘家祜.基于網絡藥理學的藥物研發新模式[J].中國新藥與臨床雜志，2009，28（10）：721-726.

[11] WISHART DS，FEUNANG YD，GUO AC，et al. DrugBank 5.0： a major update to the DrugBank database for 2018[J].Nucleic Acids Research，2018，46（1）： 1074-1082.

[12] Alex Bateman，Maria Jesus Martin.UniProt： the universal protein knowledgebase[J].Nucleic Acids Res， 2018，46（5）：2699.

[13] Joanna S Amberger，Carol A Bocchini，Alan F Scott，et al. Org： leveraging knowledge across phenotype-gene relationships[J].Nucleic Acids Research，2019，47（1）： 1038-1043.

[14] Ahmed Zeeshan，Zeeshan Saman，Mendhe Dinesh，et al. Human gene and disease associations for clinical- genomics and precision medicine research[J].Clinical and Translational Medicine，2020，10（1）：297-318.

[15] Szklarczyk Damian，Gable Annika L，Nastou Katerina C，et al.The STRING database in 2021： customizable protein–protein networks， and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets[J].Nucleic Acids Research，2021，49（1）： 605-612.

[16] Kalifa Manjang，Shailesh Tripathi，Olli Yli-Harja，et al. Graph-based exploitation of gene ontology using GOxploreR for scrutinizing biological significance[J]. Scientific Reports，2020，10（1）：25-29.

[17] Kanehisa Minoru，Furumichi Miho，Sato Yoko，et al. KEGG： integrating viruses and cellular organisms[J]. Nucleic Acids Research，2021，49（1）：545-551.

[18]馬納，李亞靜，范吉平.槲皮素藥理作用研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2018，20（8）：221-224.

[19] Bian Yifei，Lei Jiaqi，Zhong Jia，et al.Kaempferol Reduces Obesity， Prevents Intestinal Inflammation， and Modulates Gut Microbiota in High-fat Diet Mice： Kaempferol reduce inflammation and dysbacteria[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2021（99）：108840.

[20]陳元堃，曾奧，羅振輝，等.β-谷甾醇藥理作用研究進展[J].廣東藥科大學學報，2021，37（1）：148-153.

[21]戴紅偉，周嬌.槲皮素對急性淋巴細胞白血病模型小鼠凝血功能的影響[J].中國中醫急癥，2018，27（6）：970-973.

[22] Jesse A Stokum，Volodymyr Gerzanich，J Marc Simard.Molecular pathophysiology of cerebral edema[J]. Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism，2016， 36（3）：513-538.

[23] Shah SA，Lee HY，Bressan RA，et al.Novel osmotin attenuates glutamate-induced synaptic dysfunction and neurodegeneration via the JNK/PI3K/Akt pathway in postnatalrat brain[J].Cell Death & Disease，2014（5）：1026.

[24] Yanni Lv，Wen Liu，Zhaohui Ruan，et al.Myosin IIA Regulated Tight Junction in Oxygen Glucose-DeprivedBrain Endothelial Cells Via Activation of TLR4/PI3K/Akt/ JNK1/2/14-3-3ε/NF-κB/MMP9 Signal Transduction Pathway[J].Springer US，2019，39（2）：301-319.

[25] Yule Wang，Guangxu Xiao，Shuang He，et al.Protectionagainst acute cerebral ischemia/reperfusion injuryby QiShenYiQi via neuroinflammatory networkmobilization[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2020 （125）：109945.

[26]張極星，張艷國，趙亮，等.急性期腦出血患者血清ICAM-1、MMP-9、TNF-α、IL-6水平和出血灶周圍水腫腦組織體積的相關性[J].山東醫藥，2017，57（27）：58-60.

[27] Cárdenas-Rivera Alfredo，Campero-Romero Aura N，Heras-Romero Yessica，et al.Early Post-stroke Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Hinders the Receptor 1-Dependent Neuroprotection Afforded by the Endogenous Ligand[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience，2019（13）：270.

[28] Geiseler Samuel J，Morland Cecilie.The Janus Face ofVEGF in Stroke[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（5）：1362.

[29] Moon Sunhong，Chang MiSook，Koh SeongHo，et al. Repair Mechanisms of the Neurovascular Unit after Ischemic Stroke with a Focus on VEGF[J].International Journal of Molecular Sciences，2021，22（16）：8543.

[30] Yao Yi，Zhang Yonggang，Liao Xiaoyang，et al.Potential Therapies for Cerebral Edema After Ischemic Stroke： A Mini Review[J].Frontiers in Aging Neuroscience，2021（12）：618819.

[31] Luo Zheng Wei，Ovcjak Andrea，Wong Raymond，et al. Drug development in targeting ion channels for brain edema[J].Acta Pharmacologica Sinica，2020，41（10）： 1272-1288.

[32]Robert Stephanie M，Reeves Benjamin C，Alper Seth L，et al.New drugs on the horizon for cerebral edema： what’s in the clinical development pipeline？[J]. Expert Opinion on Investigational Drugs，2020，29 （10）：1099-1105.

[33]Lee YuChen，Kao ShungTe，Cheng ChinYi.Acorus tatarinowii Schott extract reduces cerebral edema caused by ischemia-reperfusion injury in rats： involvement in regulation of astrocytic NKCC1/AQP4 and JNK/iNOS- mediated signaling[J].BMC Complementary Medicine and Therapies，2020，20（1）：374.

[34]Yang Changjun，Hawkins Kimberly E，Doré Sylvain，et al.Neuroinflammatory mechanisms of blood- brain barrier damage in ischemic stroke[J].Am J Physiol Cell Physiol，2019，316（2）：135-153.

[35]Zhang Shanshan，Gong Peng，Zhang Jiangsong，et al. Specific Frequency Electroacupuncture Stimulation Transiently Enhances the Permeability of the Blood- Brain Barrier and Induces Tight Junction Changes[J]. Frontiers in Neuroscience，2020（14）：582324.

[36]Galdamez Laura A，Brunstetter Tyson J，Lee Andrew G，et al.Origins of Cerebral Edema： Implications for Spaceflight-Associated Neuro-Ocular Syndrome[J]. Journal of Neuro-Ophthalmology： the Official Journal of the North American Neuro-Ophthalmology Society， 2020，40（1）：84-91.

[37]Fan Hong，Tang Hai Bin，Chen Zhe，et al.Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury[J].Journal of Neuroinflammation，2020，17（1）：295.

[38]Voet Sofie，Srinivasan Sahana，Lamkanfi Mohamed，et al. Inflammasomes in neuroinflammatory and neurodegenerative diseases[J].EMBO Molecular Medicine，2019，11（6）：e10248.

[39]馬作峰，黃密，姜瑞雪，等.固本健腦法對老年健忘大鼠海馬組織中AGEs/RAGE信號通路的影響[J].中華中醫藥學刊，2017，35（4）：954-957.

（收稿日期：2021-07-20）