交叉引物恒溫擴增法診斷結核病的價值

高嚴

【摘要】? 目的? 評價交叉引物恒溫擴增法（crossing-primeramplification，CPA）檢測技術診斷結核病的價值。方法? 分析涇縣醫院2019年1月- 2021年6月進行CPA檢測的207例疑似結核病住院患者的臨床資料，并與羅氏培養檢測、涂片改良抗酸染色鏡檢、結核抗體（tuberculosis antibody，TB-Ab）檢測的實驗結果相對比，評價各檢測方法的診斷效能。結果? 以羅氏培養為金標準，CPA檢測的靈敏度和特異度分別為63.1%、95.1%，且和羅氏培養結果具有中高等程度的一致性（Kappa=0.626），診斷效能優于涂片改良抗酸染色鏡檢和結核抗體診斷技術。結論? CPA檢測技術與羅氏培養的檢測結果相似，但方法簡便、快速，可用于疑似結核患者的快速診斷。

【關鍵詞】? 結核分枝桿菌;交叉引物恒溫擴增;回顧性分析

中圖分類號? R521? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2022）17--02

結核病是一種慢性傳染病，由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起。2020年我國估計的結核病新患病人數為84.2萬，估算的結核病發病率為59/10萬，在結核病高負擔國家中結核病新患病人數僅低于印度[1]，結核病的防治依然嚴峻。為了能有效防治結核病，需要在疾病早期能夠有一種檢測技術可以快速地檢測并診斷出MTB。傳統的檢測方法是從臨床標本中（主要是痰液）經過抗酸染色或者培養來鑒定MTB，但它們各自都有優缺點。隨著檢測技術不斷發展，MTB的分子學檢測技術得到廣泛的應用。交叉引物恒溫擴增法（crossing-primeramplification，CPA）檢測技術是其中一種快速分子診斷方法，它檢測的是結核桿菌復合群特異性的IS16110序列。在恒溫條件下，可以一次性進行基因片段的特異性擴增和雜交，然后在密閉的一次性核酸檢測裝置中使用免疫層析技術，定性檢測特異性擴增產物，是中國自主創新的技術[2]。本研究采用對比方式，分析CPA對結核病的診斷價值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

以涇縣醫院2019年1月- 2021年6月進行CPA檢測的207例疑似結核病住院患者為研究對象。標本中痰液194例，胸腔積液11例，肺泡灌洗液1例，膿汁1例。本研究以羅氏培養法為金標準，共確診65例結核病，其中男55例，女10例，年齡24～88歲;非結核患者142例，其中男111例，女31例，年齡18～86歲。

1.2? 納入排除標準

（1）納入標準：咳嗽，咳痰>2周，痰中帶血或咯血以及肺部影像學檢測異常等肺結核疑似癥狀的患者。

（2）排除標準：正在進行規范化抗結核治療且時間>2周的患者;經綜合判斷標準未能明確診斷或排除肺結核可能的患者。

1.3? 檢測方法

（1）CPA檢測：采用杭州優思達的檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙條法），標本需要經過液化、洗滌的手工步驟進行前處理，然后加入DNA提取液進行核酸提取，再將提取的核酸加入玻璃化試管中，恒溫擴增1h，最后放入檢測裝置中讀取結果。

（2）TB-Ab檢測：采取膠體金法，吸取約100μl的血清或血漿加入試劑的樣品孔中，15～20min判讀結果。結果判斷依據試劑說明書。

（3）涂片法：采用改良抗酸染色，標本的處理以及涂片染色步驟和結果判讀按照《WS 288-2017肺結核診斷》附錄B中的操作步驟進行。

（4）羅氏培養法：采用酸性改良羅氏固體斜面培養，痰液需要加入4%氫氧化鈉進行前處理，然后按照參考文獻進行標準化操作[3]。

1.4? 統計學方法

數據統計分析采用SPSS 25.0統計軟件。計數資料組間率的比較采用χ2檢驗。計算各檢測方法的靈敏度、特異度與Kappa值。P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 4種檢測方法的陽性檢出率比較

4種檢測方法中，羅氏培養的陽性率最高，涂片法的陽性率最低，組間陽性率比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2? 以羅氏培養法為金標準各檢測方法的診斷效能

以羅氏培養為金標準，CPA檢測診斷的靈敏度最高，特異度略低于涂片法，并且與金標準診斷結果有較高的一致性，且高于其他兩種方法，具有臨床應用價值，見表2。

3? 討論

TB-Ab是對MTB的免疫學檢測方法。TB-Ab檢測操作簡單，檢測速度快，十幾分鐘可以報告檢測結果。在本次研究中TB-Ab檢測結核病的陽性率為25.1%，雖然和羅氏培養法的陽性率差異無統計學意義，但是TB-Ab陽性結果只能反映既往感染過MTB，且不能區分卡介苗接種導致的陽性，易造成假陽性。標本溶血或嚴重脂血也會對結果造成干擾，患者感染MTB早期，以及免疫功能低下或免疫缺陷又會導致結核抗體檢測陰性，這是TB-Ab靈敏度低，以及和羅氏培養法結果一致性較差的原因。因此TB-Ab適合對疑似患者的篩查，其結果需結合其他檢測結果綜合判斷。

羅氏培養法、涂片抗酸染色鏡檢是病原學檢測手段。在本研究中羅氏培養的陽性檢出率（31.4%）高于涂片抗酸染色（18.4%），有較好的陽性率，也是結核病診斷的金標準。但是由于結核桿菌在培養基上生成緩慢，約2～4周才能形成菌落，培養8周無菌落生長，才能報告陰性結果，這嚴重制約了結核病的早診斷早治療。涂片抗酸染色鏡檢方便快捷，但其陽性率較低，陽性結果依賴于標本中細菌的含量，易造成漏診，也不利于結核的診斷。

CPA檢測是分子學檢測手段，在本研究中CPA檢測的陽性檢出率為23.2%，略低于羅氏培養的陽性率31.4%。以羅氏培養為金標準時CPA檢測的靈敏度為63.1%，特異度為95.1%，Kappa=0.626，兩者檢測結果具有中高程度的一致性，這與坦桑尼亞的一項研究結果相似[4]，但靈敏度和一致性略低于姜曉穎等[5]的一項多中心研究。推測可能的原因在于CPA檢測中核酸提取步驟需要手工操作多次，可能會造成核酸物質的損失，另外因為為回顧性研究，無法知道送檢的痰液標本的質量，雖然醫護人員會進行指導，但患者在自取痰液時執行度有待商榷。相比羅氏培養，CPA檢測檢測速度快，2h左右報告結果，其結果在密閉的裝置中讀取，可避免污染，減少假陽性產生[6]。在等待培養結果的過程中可用于快速鑒定MTB。此外有關文獻報道，在肺外結核診斷中，以臨床診斷為標準，CPA法在菌陽性結核患者中與羅氏培養法有較好一致性，在菌陰性結核患者中優于羅氏培養法[7]，可見CPA檢測也能很好地診斷肺外結核。CPA檢測技術對結核有較好的檢測效能。

綜上所述，CPA檢測操作簡便，不需要復雜的儀器，利于快速檢測。對于疑似的結核患者，可使用TB-Ab對其進行結核病的初篩，再使用CPA檢測等分子檢測手段快速診斷，并與涂片鏡檢和培養比較，結合影像學和臨床表現綜合分析對結核病進行早診斷、早治療。

4? 參考文獻

[1] Organization WH.Global tuberculosis report 2021[R].Geneva：World Health Organization，2021.

[2] 王爍程，張林波.結核病實驗室檢測技術研究進展[J].中國動物檢疫，2020，37（3）：78-85.

[3] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等.分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊[M].北京：人民衛生出版社，2013：37-49.

[4] Mhimbira FA，Bholla M，Sasamalo M，et al.Detection of mycobacterium tuberculosis by EasyNAT diagnostic kit in sputum samples from Tanzania[J].J Clin Microbiol，2015，53（4）：1342-1344.

[5] 姜曉穎，尹韶華，黃海榮，等.交叉引物擴增法對初診肺結核患者檢測效能的多中心研究[J].中國防癆雜志，2017，39（7）：746-750.

[6] Xu G，Hu L，Zhong H，et al.Cross priming amplification： mechanism and optimization for isothermal DNA amplification[J].Sci Rep，2012，2：246.

[7] 毛秀軍，葛曉勵，高景利.交叉引物擴增技術在肺外結核早期診斷中的價值[J].中國生物制品學雜志，2016，29（6）：637-640.

[2022-02-12收稿]

作者單位：242500? 安徽省宣城市，涇縣醫院檢驗科