基于動態散斑干涉的數字全息成像技術研究

陳健兵，葛 磊，文永富

1.江西高瑞光電股份有限公司，江西 上饒 334100；2.北京理工大學光電學院，北京 100081

1 前言

在過去的幾十年里，散斑干涉技術在電子散斑干涉測量(electronic speckle pattern interferometry，ESPI)和散斑剪切干涉測量(speckle shearing interferometry，SSI)領域得到了廣泛的應用，以測量具有光學粗糙表面的物體的面內及面外位移和振動[1]。散斑場照明也被應用于其他各種光學成像領域，如結構照明顯微鏡(SIM)[2]、激光散斑對比成像(laser speckle contrast imaging，LSCI)[3]、近場傅里葉層析成像[4]、旋轉相干散射(ROCS)顯微鏡[5]等。最近，由于動態散斑照明(dynamic speckle illumination，DSI)可有效減少、去除圖像中的散斑噪聲，該技術已被用于生物標本的光學輪廓測量和定量相位顯微鏡(QPM)[6-11]。這種類型的照明與傳統光源如鹵素燈、發光二極管(LED)和激光不同，其具有高時間相干性與較低的空間相干性、高空間相位靈敏度、可擴展的視場(FOV)和分辨率以及高空間帶寬積[6-16]。

在干涉測量的早期，由于沒有像激光這樣的純單色光源，研究人員采用針孔對熱光源、白光(WL)進行空間濾波，以提高了光源的空間相干性，但這以巨大的強度損失為代價。此外，白光光源具有較大的光譜帶寬，即由大量單色光譜分量組成，將干涉條紋限制在相機有限干涉視場(interference field of view，iFOV)中。此外，它還使得QPM光路的搭建相對困難，主要要求參考光和物光兩路光程差要幾乎相等，以匹配光源時間相干長度(TC)(1～2 μm)內的光程。人們可以通過使用窄帶通發光二極管或在白光光束路徑中插入光譜濾波器[也稱為過濾白光(FWL)]來增加iFOV，但代價是強度進一步損失。相反，窄帶激光器克服了有限iFOV的限制，如白光、過濾白光的情況。然而，由于激光的時間相干長度很長，不可避免會產生相干噪聲和寄生條紋，導致圖像質量降低。因此，它降低了系統的空間相位靈敏度和測量精度。與傳統光源相反，DSI具有高時間相干長度和低空間相干(SC)長度。與傳統光源不同，DSI的高時間相干長度和低空間相干長度有助于在整個相機FOV上實現相干無噪聲干涉圖案。

盡管DSI優于傳統光源，但動態散斑照明定量相位顯微鏡(DSI-QPM)較為受限，可能是由于缺乏深入了解。在DSI-QPM中，當物光散斑場和參考光散斑場相互疊加時，必須生成相關散斑場以形成干涉圖案[11]。然而，DSI-QPM系統中干涉條紋的獲得，對于實驗條件存在一些常見的誤解[14,15]。

本文基于DSI-QPM搭建了反射式離軸光路系統和透射式共光路離軸干涉系統，分別對USAF1951(表面鍍銠高度為110 nm)標準分辨率版和人體紅細胞進行了相位成像。同時對比分析了DSI-QPM系統的時空噪聲。首先，對于反射式結構而言，DSI-QPM系統的空間噪聲(1.89 nm)和時間噪聲(0.56 nm)均顯著小于激光照明QPM系統空間噪聲(16.78 nm)和時間噪聲(21.54 nm)。其次，為了驗證DSI可以在整個相機FOV實現相干無噪聲干涉圖樣，本文還搭建了動態散斑照明的共光路離軸干涉系統并對比分析了動態散斑與鹵素燈照明的時空噪聲。結果表明，本文采用的基于動態散斑干涉的數字全息顯微系統具有低空間相干性、高空間相位靈敏度、可擴展的視場(FOV)和分辨率等優勢。

2 原理

多個隨機相位復雜分量的疊加導致3D空間中的不規則圖案稱為散斑圖案，這是一種粒狀結構。時空單個點的疊加散斑A(x,y,z)分布可用式(1)表示：

(1)

(2)

圖像平面上的平均散斑大小可以由式(3)給出：

d=1.22(1+M)λF

(3)

式中，λ為照明波長，M為光學系統放大倍率，F為透鏡的f-數(焦距/有效孔徑)。

被測物體的物光波A1(x,y)和參考光波A2(x,y)在CCD上進行干涉，形成干涉全息圖，其干涉條紋的強度分布見式(4)。

H(x,y)=|A1(x,y)|2+|A2(x,y)|2+

2·|A1·A2|cos(Δφ+x·ksinα)

(4)

式中，Δφ為相位差，k和α分別為波數和離軸干涉角。

如果在探測器的積分時間“T”內對大量隨時間變化的散斑場進行平均，則積分強度可用式(5)表示：

(5)

在全息再現過程中，可以通過算法將被測樣品的強度信息和相位信息恢復出來。全息再現算法有菲涅爾積分變換法、卷積法、角譜法等[16-19]，本文采用角譜法對全息圖重建，由于其在推導過程中不存在限制近似條件，故該方法可以實現對衍射光波的準確描述。角譜法對全息圖重建得到的物光波復振幅分布，見式(6)。

(6)

式中，fx=x/λd，fy=y/λd，d為再現距離，λ為波長，F{·}、F-1{·}分別表示傅里葉變換和傅里葉逆變換。最終再現像的光強和相位分布分別為：

I(x,y;d)=|O(x,y;d)|2

(7)

(8)

式中，Im表示取復振幅的虛部，Re表示取復振幅的實部。

以反射式為例，假設物體的高度為h，那么對于波長λ記錄下的數字全息圖，數值重建得到的相位分布可以表示為式(9)。

(9)

其中，φ0是位于[0,2π]之間的主相位，m為非負整數，n為樣本折射率，n0為空氣折射率。式(9)中的m·2π表示2π包裹相位的個數為m。如果m=0，則相位圖中沒有包裹相位。由式(9)可得待測物體的高度，見式(10)。

(10)

3 實驗裝置與結果

為了驗證動態散斑干涉全息數字全息成像系統的可行性，實驗分別采用反射式離軸數字全息系統和透射式共光路離軸數字全息系統。用于記錄的激光器為λ=660 nm的半導體激光器，所用CCD為黑白相機，其分辨率為2592×1944，像素尺寸為2.2 μm×2.2 μm。

反射式光路結構如圖1所示，激光器發出的激光經旋轉毛玻璃(粒度2000)后進入MO1(25× NA = 0.4)，之后經過空間濾波器(SF)和準直鏡(L1,f=50 mm)進行擴束準直。光束準直后由透鏡L1(f=150 mm)進行傅里葉變換，經分光棱鏡(BS)后分為兩路：一路經MO2(40× NA=0.6)后照射樣本，一路經MO3(20× NA=0.5)后照射可調節反射鏡。物光由樣本反射后經物鏡、分光棱鏡直接投射到CCD(daA2500-14 μm，Basler)上，參考光則通過調整反射鏡引入載波。最終參考光以一定夾角與物光形成離軸干涉，干涉圖樣如圖2所示。為了驗證該系統具備可拓展的分辨率和視場，該實驗中的MO2和MO3并不相同，這亦說明了該系統可實現20×～40×的可調分辨率。

圖1 反射式動態散斑干涉的離軸全息裝置圖圖中MO1～3為物鏡；SF為空間濾波器；L1-2為透鏡；BS為分光棱鏡；M為反射鏡

圖2 反射式動態散斑照明(a)和激光照明系統(b)采集全息圖對比

為了驗證反射式系統的時空特性，本文以10 frame/s的幀率對圖2(a),(b)各采集了300張全息圖進行分析。系統中CCD獲取的全息圖尺寸大小為2592×1944，由于計算量太過龐大，為此各截取了300張相同位置820×850無物體區域，用來計算該系統的時空噪聲。用相位重構算法解出300張全息圖的相位展開圖。將第一張全息圖重構出的相位圖作為背景相位圖φ0(x,y;0)，其余重構出的相位圖φ(x,y;t)減去該背景圖，即Δφ=φ(x,y;t)-φ(x,y;0),可以得到299張去掉背景噪聲后的相位圖。由光程差Δδ=λ·Δφ/2π，可以計算得到系統的隨機光程分布(optical path difference)。對299張隨機光程分布圖的任一張求均方差，即為該時刻的空間噪聲。圖3(c)為圖3(a),(b)的光程分布直方圖。對299張隨機光程分布圖的所有像素求均方差，即為系統的時間噪聲。圖3(d)為299張隨機光程分布圖所有像素的直方圖。共聚焦顯微鏡標定結果見圖4(c1)～圖4(c4)，可以看到USAF1951分辨率版的鍍銠表面高度為110 nm。從圖4(a1)～圖4(a4)可以看到，該系統的散斑噪聲得到了抑制，表明該系統具有較低的空間噪聲，這說明動態散板干涉系統具有良好的測量精度。同樣，離軸全息成像系統(DSI-DHM)時間噪聲為0.56 nm，這表明該系統同樣適合于長時間觀測，同時還可以避免激光引入的散斑噪聲。

圖3 反射式系統時空噪聲分析(a)、(b)分別為散斑照明和激光照明系統隨機光程差；(c)為散斑照明和激光照明系統的空間噪聲分布；(d)為散斑照明和激光照明系統的時間噪聲分布

圖4 圖3(a)、(b)系統重建結果比較圖(a1)、(b1)：重建得到的USAF1951分辨率版強度圖；(a2)、(b2)：三維相位圖；(a3)、(b3)：三維高度圖；(a4)、(b4)：黑色實線處高度分布曲線；單像素尺寸為123 nm；(c1)～(c4)為共聚焦顯微鏡標定結果，單像素尺寸為94 nm；上述所有數據均為USAF1951分辨率版第6組

透射式光路結構如圖5所示，激光器發出的激光經旋轉毛玻璃(粒度2000)后進入MO1(25× NA=0.4)，之后經過空間濾波器(SF1)和準直鏡(L1,f=50 mm)進行擴束準直。準直光束經過L2聚焦后照射樣本，攜帶樣本信息的光束經物鏡后成像，像平面于一維光柵表面重合。像平面光波經一維光柵(100 lp/mm)后發生多級衍射，為了方便闡述，圖示只顯示了0級衍射級次和+1級衍射級次。這樣攜帶有物體信息的平行光束經過一維周期光柵后發生多級衍射，各級衍射光經過透鏡L3，在透鏡L3的傅里葉頻譜面上可以得到各級衍射光的頻譜信息。采用空見光濾波器(SF2)將其他級次衍射光全部去掉，僅保留0級衍射光的低頻信息和+1級衍射光的全部頻譜信息。因此，+1級衍射光攜帶有被測物體的相位信息，作為物光波；0級衍射光沒有攜帶被測物體的相位信息，作為參考光波；由于0級衍射光(參考光波)和+1級衍射光(物光波)存在夾角，且滿足相干條件，因此會在成像探測器靶面上發生干涉，形成離軸全息圖，并由成像探測器記錄。

圖5 透射式動態散斑干涉的共光路離軸全息裝置圖MO為物鏡；SF1,2為空間光濾波器；L1～3為透鏡

為了驗證透射式共光路離軸干涉全息系統的時空特性，本文以10 frame/s的幀率對分別采用動態散斑照明和熱光源鹵素燈照明的離軸干涉全息系統各采集300無物體全息圖進行分析，計算方法與上述反射式相同。圖6(a)和圖6(b)分別記錄了同一時刻鹵素燈照明和動態散斑照明系統的隨機光程差，為了便于直觀比較，色階圖范圍均設置為[-1,1]?？梢钥吹?，動態散斑照明系統的空間噪聲(0.0826 rad)和鹵素燈照明系統的空間噪聲(0.0550 rad)相差不大。這說明激光的散斑噪聲得到了很好的抑制，且可以直觀地從圖6(b)看出其空間噪聲主要由衍射條紋引入。這是因為對于特定波長的激光動態散斑而言，其時間相干(TC)長度幾乎和同頻激光光源時間相干長度沒有區別，且其空間相干長度在空間光濾波器的調制下得到了提升。這也解釋了激光動態散斑干涉系統為什么可以克服傳統熱光源有限干涉視場(iFOV)的局限。采集的300張全息圖，在時間尺度上為30 s，圖6(c)描述了每個時刻系統對應的空間噪聲，對所有時刻的空間噪聲求均方差即為該系統的時間噪聲。由于動態散斑系統和鹵素燈系統波長不一致，因此下述為了較為統一比較，均采用相位噪聲。從圖6(c)可以看到，動態散斑系統的時間噪聲(1.51 mrad)明顯高于鹵素燈系統的時間噪聲(0.17 mrad)。同樣，可以根據式(10)將相位轉換為高度。經換算，動態散斑系統的時間噪聲為0.158 nm，鹵素燈系統的時間噪聲0.0156 nm。也就是說，動態散斑系統的相位靈敏度相對較弱，這一定程度受到了旋轉散斑片帶來的機械式干擾。一般來說，在實際測量過程中旋轉散斑片機械式的震動不可避免。因此，一方面，需要盡可能在旋轉散斑片組件中添加防震片同時和光路結構隔離開；另一方面，可以積極探討非機械式降低激光相干性的方法。

圖6 透射式共光路離軸干涉系統時空噪聲分析(a)、(b)分別為鹵素燈照明和動態散斑照明系統隨機光程差；(c)為鹵素燈照明和動態散斑照明系統所有時刻的空間噪聲

對于動態散斑照明的透射式共光路離軸干涉系統，本文采用人體紅細胞進行定量測量，其中成像物鏡為20倍。從圖7(a)可以看到，參考光透過空間濾波器后發生了衍射，給全息圖引入了一定的條紋噪聲。這是因為，對于動態散斑而言，其相干長度太短不足以實現非共光路結構的離軸干涉。從圖7(b)重建的相位圖像可以看出，激光散斑噪聲得到了較好的抑制。同樣，該系統利用傳統發光二極管(LED)照明亦可實現，且空間相位靈敏度更高。但是，如果同時兼顧熒光成像模塊，那么系統仍需特定波長的動態散斑照明。所以說，相較于傳統LED照明系統，DSI也并非完全處于劣勢。對于此透射式共光路點衍射相位成像系統而言，DSI具有高時間相干長度和低空間相干(SC)長度。與傳統光源不同，DSI的高時間相干長度和低空間相干長度有助于在整個相機FOV上實現相干無噪聲干涉圖案。

圖7 透射式動態散斑照明共光路離軸干涉系統測量結果(a)系統采集全息圖；(b)重建相位圖；(c)圖7(b)中黑色方框內局部放大三維圖；(d)圖7(c)中黑色虛線描述的高度二維輪廓圖

4 總結

本文從實驗出發，初步驗證了DSI的可行性，反射式系統展示了它在離軸數字全息顯微鏡的物光路和參考光路中使用不同物鏡的能力，而不會降低干涉條紋對比度，并提供了使用用戶定義的顯微鏡物鏡的靈活性，從而提供優于低時間相干光源的競爭優勢。同時，透射式動態散斑照明系統可以同時兼顧LED成像功能，同時還可以直接作為熒光成像照明，這對于集成式多模態顯微鏡顯得尤為重要。實驗結果初步驗證了基于DSI數字全息系統具有低空間高時間相干性、高空間相位靈敏度、可擴展的視場(FOV)和分辨率等優勢。為了進一步提高動態散斑照明的空間相位靈敏度，機械式的旋轉散斑片并不可取，這會給光源帶來一定的擾動從而降低系統的空間相位靈敏度。因此，全新的非傳統機械式的降低激光相干性的方式亦值得探索。