西藏地區牦牛源沙門菌分離鑒定、血清分型及致病性研究

李天嬌，班馬澤郎，李登宇，張開琴，趙曉慧，王保寧，2，索朗斯珠

(1.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，成都 610041)

1 引 言

沙門菌(Salmonella)為革蘭氏陰性短小桿菌，腸桿菌科沙門菌屬[1].據國內外研究報道，沙門菌在多種動物中均有發現，在動物相關副產品及食材中也常有檢出，所以沙門菌也是食源性疾病中最常見的病原菌之一，動物感染沙門菌時，常引起胃腸炎及局部炎癥，嚴重時會引起不同程度的敗血癥[2-4].成牛感染時臨床表現為水樣或血樣腹瀉，嚴重時表現為呼吸系統疾病或流產；犢牛感染時死亡率高于成牛[5].牦牛是生長在我國高海拔地區的特有物種，西藏作為我國牦牛主產地之一，牦牛更是當地牧民的重要經濟來源之一[6].自關龍伏等人[7]于1985年首次報道從青海牦牛源中分離出沙門菌后；張斌等[8]、柏雪等[9]和馮蘭等[10]也陸續報道了青海、四川等地牦牛源沙門菌相關研究，說明沙門菌在高海拔牧區長期處于流行狀態.加之，沙門菌主要以糞-口傳播，牧區養殖模式又以放牧為主，利于沙門菌的傳播，嚴重影響當地牦牛養殖產業的健康發展.

沙門菌血清型多達2500種，常見血清型均具有一定致病性，同時根據宿主的感染范圍不同，血清型也會有所不同，致病性也有所差異[11].牛沙門菌病可由多種血清型引起，都柏林沙門菌為其中最主要的血清型，牛作為其天然宿主極易被感染，沙門菌也易導致母牛流產，犢牛死亡.了解宿主的優勢血清型及致病性強弱，有助于為相關疫病提出較為針對性的防控管理措施.

目前，國內外針對牦牛源沙門菌的研究較少，西藏地區沙門菌感染情況、菌株的分離鑒定和優勢血清型等相關方面的研究更甚.因此，本研究通過采集西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等西藏全部七地市牦牛源腹瀉樣品，對樣品中的沙門菌進行分離鑒定及血清型分型，旨在了解西藏各地區牦牛源沙門菌感染情況及優勢血清型分布情況，同時隨機選取本試驗中優勢血清型沙門菌一株進行動物試驗和病變組織切片，旨在了解其菌株的致病性強弱.為后續相關方面深入研究提供理論基礎和數據支持.

2 材料與方法

2.1 材 料

牦牛源新鮮腹瀉糞便，采集自西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等七地市，共199份，樣品具體分布情況見表1.樣品采集后及時編號，保存至-20 ℃冰箱.

表1 樣品分布情況

BPW培養基、MRSV培養基購自美國BD公司；LB培養基、TTB培養基、SS培養基、BS培養基、TSI培養基、營養瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自青島海博生物技術有限公司；TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL 2000 DNA marker購自大連寶生物有限公司.試驗動物為SPF級，4～6周年齡、體重18～20 g的KM小鼠72只，購自成都達碩實驗動物有限公司.

2.2 方 法

2.2.1 細菌分離培養 將采集的樣品參照GB4789.4-2010[12]和Liu等人[13]的方法進行分離培養.將樣品接種于BPW培養液中，進行前期預增菌；將上述增菌液接種在MRSV半固體培養基上，進行初篩；初篩后的菌液在SS、XLT4選擇性培養基上復篩；篩選出的單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢；并將符合形態特征的菌落接種于TTB培養液進行純化.

2.2.2 生化試驗 將TSI固體培養基制成斜面培養基，將純培養菌液在TSI培養基上進行斜面穿刺，37 ℃培養12 h后觀察結果.

2.2.3 PCR鑒定 利用高溫裂解法提取菌株的DNA，并利用PCR技術檢測菌株的特異性鑒定基因invA[14]，引物序列：5′-GTGAATTATCGCACGTTCGGCAA-3′；5′-TCATCGCACGTCAAAGGAACC-3′.將引物序列送至上海生工生物科技有限公司合成.

反應總體系25 μL，其中：DNA模板2 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補充至25 μL.退火溫度為61 ℃，共35個循環.PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將擴增產物送至上海生工生物科技有限公司測序.

2.2.4 血清型鑒定 將TSB中純培養菌液接種于營養瓊脂上，37 ℃培養12 h.將培養基中的單菌落在玻片上與TR101沙門菌屬血清診斷試劑盒(寧波天潤生物藥業有限公司)中的血清混合，觀察凝集的情況并記錄凝集情況，血清凝集結果根據Kauffman-white[15]標準進行分析.

2.2.5 測定菌株LD50從此次菌株優勢血清型(Salmonelladublin)中隨機選取一株沙門菌，該菌株編號為H42，測定其LD50.將馴養后的KM小鼠隨機分成7組試驗組，1組對照組，1組空白組，每組各8只小鼠.

表2 試驗組小鼠注射菌量

2.2.6 病理切片 將攻毒后24 h內(急性)死亡小鼠，72 h后(慢性)死亡小鼠立即解剖后，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、胃組織、腸組織于無菌生理鹽水洗滌后，用4%多聚甲醛進行固定，并將組織委托成都里來生物有限公司制作HE切片進行觀察，并記錄結果.

3 結 果

3.1 細菌分離純化

將疑似菌落接種于SS固體培養基和BS固體培養基上，菌株在SS平板上生長出透明且中心帶黑點的圓形單菌落，在BS平板上生長出黑褐色且帶有金屬光澤的圓形單菌落，將疑似單菌落染色鏡檢后，顯微鏡油鏡下觀察為粉紅色短小桿菌.以上特征均符合沙門菌生長特性及形態學特征，結果見圖1.

圖1 分離菌株的菌落形態和鏡檢結果

分離菌株均能與TSI反應生成H2S黑色沉淀，且分解TSI中葡萄糖，使斜面變紅，表面氧化后則變黃，符合沙門菌生化特性.

疑似沙門菌的單菌落進行特異性基因invA檢測顯示，分離菌株目的條帶約為284 bp，與預期條帶大小相似，結果見圖2.將PCR結果結合培養特性、形態學特征及生化特性結果顯示：西藏7地市共分離出50株沙門菌，檢出率為25.13%(50/199).其中拉薩19株，檢出率為32.20%(19/57)；林芝9株，檢出率為19.57%(9/46)；那區7株，檢出率為19.44%(7/36)；日喀則2株，檢出率為20.00%(2/10)；山南4株，檢出率為28.57%(4/14)；阿里2株，檢出率為13.34%(2/15)；昌都7株，檢出率36.84%(7/19).本次分離結果中，拉薩、昌都和山南三地分離率相較于其他四地較高，阿里地區的分離率最低.

圖2 牦牛源沙門菌invA基因PCR結果

3.4 血清型鑒定

本次血清型分型結果顯示：50株沙門菌共分屬B群、C1群、C2群、D群4種血清群，含都柏林沙門菌、傷寒沙門菌、阿邦尼沙門菌等血清型共18種.按血清群統計結果顯示：4種血清群中，以D群所占血清菌株最多，為常見血清群，含5種血清型，共20株分離菌；其次是B群含8種血清型，共19株菌；C1群占3種血清型，共9株菌；C2群占2種血清型，共2株菌，具體結果詳見圖3.

圖3 50株牦牛源沙門菌所占血清群比例

從18種血清分型結果顯示：西藏地區沙門菌的優勢血清型為都柏林沙門菌共10株，占總分型菌株的20.00%(10/50)；其次是傷寒沙門菌和阿邦尼沙門菌個7株，占總分型菌株的14.00%(7/50)；接著是丙型副傷寒沙門菌共6株，占總分型菌株的12.00%(6/50)，血清型統計結果詳見圖4.

圖4 50株牦牛源沙門菌血清型分布情況

從各地沙門菌血清分型結果顯示：各地所占血清群、血清型數量均不相同.其中，拉薩市共有10種血清型，且4種血清群均有分布，以都柏林沙門菌和傷寒沙門菌為優勢血清群；林芝市共5種血清型2種血清群，以都柏林和阿邦尼沙門菌為優勢血清型；那曲市共5種血清型，以丙型副傷寒、傷寒沙門菌為優勢血清型；日喀則兩株分離菌均為伯里沙門菌；昌都市共包括6種血清型，以阿邦尼沙門菌為優勢血清型；阿里和山南分離菌株均為不同血清型，具體結果詳見表3.

表3 西藏各地市牦牛源沙門菌血清分型情況(單位：株)

3.5 牦牛源Salmonella Dublin感染小鼠的LD50

LD50試驗結果(詳見表4)，經SPSS 21.0軟件分析，牦牛源都柏林沙門菌對感染小鼠的LD50為0.368×108CFU/mL，95%置信區間為0.311×108～0.434×108CFU/mL.

表4 各組小鼠感染牦牛源都柏林沙門菌死亡情況

3.6 病理切片

光鏡下觀察小鼠組織病理切片結果顯示：急性(24 h內)死亡組小鼠的心臟、腸組織和胃組織相關細胞結構完整清晰無明顯病變，肝臟、脾臟和肺臟相關細胞出現輕微壞死和變性.慢性(72 h后)死亡組小鼠心臟間質輕微炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主；脾臟相較于急性組較為嚴重，白髓和紅髓細胞變性、壞死且細胞邊緣基本消失，免疫細胞聚集增多；肺泡上皮細胞也相較于急性組嚴重，出現上皮細胞慢性壞死；腸組織黏膜層結構模糊，大面積溶解壞死，腸腔壞死區域細胞大量壞死，部分區域出現輕微充血擴張；胃部黏膜層也壞死溶解明顯，結果詳見圖5.

圖5 牦牛源都柏林沙門菌感染小鼠各病變組織病理切片

4 討 論

沙門菌作為一類重要的食源性病原菌，宿主眾多，可感染各個年齡段的牛只，以犢牛最為常見[17].李慧明等人[18]對四川省牦牛群調查結果顯示，沙門菌引起的的牦牛發病率2.76%～34.82%，死亡率高達4.61%～47.32%.隨著研究深入，國內各地有關牦牛源沙門菌的相關報道也逐步增多，說明沙門菌在牦牛群中處于長期流行狀態，且死亡率也較高，但針對西藏牦牛源沙門菌相關研究報道卻較為少見.本次研究中，西藏地區牦牛源沙門菌總分離率為25.13%，與逯玉等人[19]從青海犢牛腹瀉樣品的分離率24.00%結果相似.本次研究結果確定沙門菌在西藏牦牛源中存在，七地市均有分離說明該細菌在西藏存在一定的流行趨勢.

目前，高原草場超載、礦元素缺乏等問題普遍存在于青藏高原等高海拔地區，這些原因可直接影響牦牛生長發育、機能維持等方面[20].而西藏整體處于該情況，加之牛群結構不合理、養殖模式單一，牛群常有未淘汰的老牛、未及時發現的病牛和抵抗力較弱的犢牛，導致牛群極易感染各類病原菌；并且在放牧情況下，病牛和隱性感染牛不易發現，污染放牧環境，加大牛群患病機率[21].本次研究結果提示我們需改善養殖方式和加強監管措施，減少感染機率，尤其分離率高的地區更應引起重視.同時，分離率最高的拉薩、昌都、山南三地，環境相似，海拔較為接近，但感染率高是否與海拔存在相關性，還需深入研究.

沙門菌對人和溫血動物致病的血清型主要集中于A～F血清群，朱曉霞等人[22]針對四川藏區沙門分群中血清型也主要集中于B群、D群中，與本次試驗中常見血清群結果相似，說明牦牛雖產地不同，但高海拔地區也存在一定的相似性.沙門血清根據宿主感染不同，存在專嗜性、偏嗜性、泛嗜性.牛沙門菌病可由多種血清型引起，都柏林沙門菌為牛源最主要的血清型，其次是鼠傷寒沙門菌，本次研究中以上兩種血清型均有分離，都柏林沙門菌更是西藏牦牛源優勢血清型[23].李慧明等人[18]針對四川牦牛源沙門菌鑒定結果顯示，菌株中21.87%為都柏林沙門菌；20世紀80年代陳含義等人[24]和滕振光等人[25]分別從青海兩地牦牛源中分離出的沙門菌也均為都柏林沙門菌；國外也曾有牛群感染都柏林沙門菌的報道.

本次試驗中牦牛源都柏林沙門菌感染KM小鼠的半數致死結果為0.368×108CFU/mL，相較于馮蘭等[10]感染小鼠的半數致死結果1.2×107CFU/mL較高，屬于強致死性菌株.隨后觀察病變組織切片發現此株都柏林沙門菌可引起宿主全身性感染，心臟組織心肌纖維變性壞死，肝臟組織肝細胞變性壞死、肝竇淤血擴張，脾臟組織淋巴細胞減少、壞死、白髓萎縮、脾血竇淤血，肺臟組織支氣管脫落、肺泡上皮細胞變性壞死、水腫、炎細胞浸潤、出血，腸組織黏膜層變性壞死、充血，胃組織黏膜層變性壞死等病理改變，與對照組相比，急性組和慢性組均可見不同程度病理改變，且慢性組整體病理程度重于急性組，其中脾臟、肺臟、腸和胃組織病變程度較重.因此，我們需重視S.Dublin引起的危害，及時制定有針對性的防控管理措施.同時此次沙門血清分型種類較多，我們也需考慮存在多種血清型引起牛只患病的情況，需要我們提高對牛群沙門菌感染情況的重視.

此次牦牛源沙門菌中還分離出鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌，這兩種血清型具有泛嗜性，擁有廣泛感染的宿主譜，可引起人和多種動物相關沙門菌病，具有重要的公共衛生學意義[26].乙型、丙型副傷寒沙門菌主要造成人類食物中毒，孔雪英等人[27]曾從牦牛肉中檢出這兩種副傷寒沙門菌，說明牦牛在屠宰過程中可能感染沙門菌，而人類食用牦牛肉時，也存在一定的感染風險.因此我們需加強在牛只屠宰到銷售過程中的監管環節，降低副產品被污染的機率.同時，病牛沙門菌作為罕見的非傷寒沙門菌，和紐波特沙門菌，在研究報道中主要是食物污染而引起的食物中毒，也需引起相關監管部門的重視[28,29].阿邦尼沙門菌毒性也較強，孫陽陽等人[30]曾在驢源中分離，陳俊等人[31]人則從鴨源中分離得到奧斯陸沙門菌，而本次牦牛源沙門分型結果中均分離得到這兩種血清型，需考慮這兩種血清型可能存在多種動物間交叉感染的情況.而伯里、阿雷查瓦萊塔、里森、塔西、仙臺等血清型相關研究報道較少，是否具有較強毒性和致病性還需進一步研究.本次分型結果中沙門菌血清型種類較多，優勢血清型特點突出，部分血清型宿主廣泛、危害較大，提示我們需引起高度重視，也可針對相關優勢血清型進行深入研究.

5 結 論

目前，國內外針對牦牛源沙門菌研究較少，有關全區牦牛源沙門菌的研究更少.本次實驗針對西藏全區牦牛源沙門菌進行分離鑒定，確定沙門菌在西藏牦牛源中確實廣泛存在，且具有一定流行趨勢；本次試驗也確定了西藏地區的常見血清群和優勢血清型；確定了牦牛源S.Dublin具有較強的致病性.為以后相關方面深入研究提供理論基礎，也為相關部門防治提供數據支撐.