麻瘋樹核糖體失活蛋白Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤的互作方式分析

鄧聿杉，徐 鶯

(四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室, 成都 610065)

1 引 言

核糖體失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins,RIPs)是一種rRNA N-糖苷酶，它能夠催化28S rRNA特定位點上腺嘌呤的糖苷鍵斷裂從而抑制蛋白質的正常合成[1].此外，這種蛋白還具有抗病毒，抗腫瘤，抗真菌等多種生物學活性，因此也受到了科研人員的廣泛關注[2].

Curcin和Curcin C均是從麻瘋樹(Jatrophacurcas)中分離得到的核糖體失活蛋白.1976年Stripe首次從麻瘋樹胚乳中分離出Curicn[3]，Barbieri等人將其鑒定為Ⅰ型RIPs[4].2017年Zhang等人從麻瘋樹的子葉中分離純化出了一種新型的RIP并將其命名為Curcin C[5].研究表明，兩種蛋白體外翻譯抑制的IC50分別是0.19 nmol/L和0.05 nmol/L，這表示它們兩者之間的N-糖苷酶活性可能存在差異[5,6].為了了解Curcin和Curcin C N-糖苷酶活性的主要差異，我們實驗室于2019年通過SWISS_MODEL對兩種蛋白質的三級結構進行了預測，并使用AutoDock將兩種蛋白與腺嘌呤進行了分子對接，通過LigPlot+對腺嘌呤與Curcin及Curcin C之間的互作方式進行了分析.受限于當時蛋白質結構預測技術的不成熟，預測得到的三級結構質量并不高.此外，當時在進行分子對接前并未對Curcin及Curicn C的活性位點信息進行預測而是直接進行對接，這也導致了對接結果并不理想，最終得到的互作方式和其它已知RIPs與腺嘌呤的互作模式之間具有明顯差異.

如今，許多結構生物學領域的生物信息學軟件不斷被開發出來，蛋白質結構預測技術也愈發成熟，這為完善之前的研究提供了良好的實驗條件.為了得到更加準確的結論，本文使用新的蛋白質預測方法對Curcin和CurcinC的三級結構進行預測，使用質量評估軟件對預測結果進行了質量評估，在對接前預測了兩種蛋白活性位點的氨基酸組成信息，最后使用分子對接方法探究了Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的相互作用模式，并對對接結果進行了比較分析，為闡明兩種蛋白N-糖苷酶活性差異的潛在機制提供了更為可靠的理論基礎.

麻瘋樹核糖體失活蛋白Curcin(Genbank登記號：NP_001295744.1)和Curicn C(Genbank登記號：XP_012074358.2)的氨基酸序列從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索獲得.蓖麻毒素A鏈與腺嘌呤的晶體復合體結構從PDB數據庫(PDBID：2p8n)中檢索獲得.

2.2 方 法

2.2.1 蛋白質三級結構預測 利用蛋白質三級結構預測軟件trRosetta[7]預測Curcin和Curcin C的三級結構.

2.2.2 模型質量評估 為了確保預測得到的蛋白質模型具備較高的質量以保證后續分析結果的有效性，本文采用PROCHECK[8]及Qmean[9]兩款質量評估軟件對預測模型進行了質量評估.

2.2.3 小分子配體的預處理 從PubChem數據庫中下載腺嘌呤的2D結構，使用Chem3D將2D結構轉化為mol2格式后進行能量最小化處理.

2.2.4 活性位點信息預測 使用UCSF Chimerav.1.12.1[10]預測Curcin和Curcin C的活性位點信息：使用MatchMaker將Ricin分別與Curcin和Curcin C進行蛋白質疊合，并基于結構進行序列比對，以Ricin活性位點信息為參考預測Curcin和Curcin C的活性位點信息.

2.2.5 分子對接 分子對接使用AutoDock4.2，預測Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的相互作用模式.對蛋白質進行預處理：加氫，計算電荷，轉換為PDBQT格式；根據預測得到的活性位點信息設置GridBox.受體蛋白設置為剛性，小分子配體設置為柔性.對接算法選用遺傳算法(Genetic Alogorithm)尋找配體合適的結合取向.

3 結果與分析

3.1 Curcin和Curcin C的三級結構的質量評估

采用PROCHECK和Qmean兩款質量評估軟件對Curcin和Curcin C的三級結構(圖1a，圖1b)進行質量評估.PROCHECK的評估結果以拉氏圖的形式呈現給用戶，結果顯示Curcin的所有氨基酸殘基中有89.4%位于拉氏圖的最可信區域，10.3%的氨基酸殘基位于次級可信區域，0.4%的氨基酸位于不可信區域(圖1c).Curcin C的所有氨基酸中有86.3%位于拉氏圖的最可信區域，13.4%的氨基酸位于次可信區域，0.4%的氨基酸位于允許區域(圖1D).通常情況下蛋白質模型的氨基酸殘基中位于最可信區域及次級可信區域的氨基酸總數占比超過90%就表示被評估的結構具備較高的質量.Qmean將評估對象與PDB數據庫中具有類似大小的非冗余結構進行比較，評估結果同樣以圖表形式返回給用戶，同時還會將評估結果量化為Qmean Z-Score.Qmean評估結果顯示，Curcin和Curcin C模型的Z-Score得分分別為-0.01和-1.16，兩者的得分都位于|Z-Score|<2的范圍內(圖1E,圖1F)，這意味著兩種蛋白的三級結構也同樣通過了Qmean的質量評估.PROCHECK及Qmean的評估結果一致顯示Curcin的模型質量要略高于Curcin C，但兩者的三級結構都通過了兩款軟件的評估標準，因此trRosetta預測得到的兩種蛋白質模型都具備較高質量，可以用于后續的實驗分析.

圖1 基于trRosetta預測的Curcin和Curcin C三維結構示意圖

3.2 Curcin和Curcin C的活性位點的預測

在分子對接之前需要確定腺嘌呤與Curcin和CurcinC結合的活性位點才能確保對接結果具有更高的準確性.本文采用UCSF Chimera v.1.12.1軟件以RicinA鏈為參考模型，將RicinA與Curcin和CurcinC基于結構進行比對(圖2)，根據比對結果及RicinA的活性位點信息預測得到了兩種蛋白活性位點的氨基酸組成信息.預測結果顯示，Curcin和CurcinC活性位點處的氨基酸組成完全一致，分別由Ala117，Tyr118，Leu119，Phe131，Gly157，Ser158，Tyr159，Pro208，Glu209以及Arg212共10個氨基酸組成.

圖2 Ricin C原子與Curcin和Curcin C疊加的立體帶狀圖

3.3 與腺苷及腺嘌呤分子的對接研究

為了比較Curcin及Curcin C的活性位點在發揮N-糖苷酶活性過程中的結構差異，本文將Curcin與Curcin C分別與腺苷及腺嘌呤兩種底物進行分子對接，對反應前后的兩種狀態進行對接分析.對接結果選用LigPlot+進行可視化分析(圖3).經AutoDock計算，Curcin與腺嘌呤之間的結合能大小為-4.92 KJ/mol,參與氫鍵相互作用的氨基酸分別是Leu119和Gly157，參與疏水相互作用的氨基酸有Ala117,Tyr118,Tyr159，Phe162以及Ile204.Curcin C與腺嘌呤之間的結合能大小為-5.18 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸有Leu119，Gly157以及Arg212,參與疏水相互作用的氨基酸有Tyr118，Phe131，Tyr159以及Ile204.不難發現，Curcin C與腺嘌呤之間的結合能要低于Curcin，但兩者之間結合能大小差異并不明顯，還不足以造成兩者在體外翻譯抑制能力上產生明顯差異.因此，兩種蛋白與腺嘌呤之間的結合能差異可能只是導致兩者體外翻譯抑制能力上產生明顯差異的原因之一.

圖3 Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤的相互作用示意圖

Curcin與腺苷之間的結合能大小為-5.65 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸有Tyr118,Leu119,Gly157,Glu209和Glu238,參與疏水相互作用的氨基酸殘基有Tyr159,Ile204和Arg212.Curcin C與腺苷之間的結合能大小為-6.07 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸殘基有Tyr118,Leu119,Glu209,Arg212和Glu238,參與疏水相互作用的氨基酸有Gly157,Tyr159和Ile204.可以發現兩種RIPs與腺苷的結合能均低于腺嘌呤.

通過Curcin和Curcin C對接結果的比較分析，我們還發現Curcin和Curicn C與腺苷及腺嘌呤的相互作用模式具有較高的相似性，但是Curcin在與兩種配體互作時都缺少一個關鍵氨基酸Arg的參與,而Arg在RIPs的活性位點中往往起著非常重要的作用.為了進一步探究Curcin與腺嘌呤相互作用時Arg缺失的原因，我們將Curcin和Curcin C結合口袋中Arg與底物腺嘌呤中N3原子之間的距離進行了測量(圖4).結果顯示Curcin中Arg與腺嘌呤的N3原子之間的最短距離為3.5 ?而Curcin C中Arg與N3原子之間的距離為2.79 ?，這意味著Curcin中Arg與腺嘌呤相互作用的缺失很有可能是因為兩者在距離上相距較遠造成的，這會影響Arg對N3原子的質子化作用從而阻礙N-糖苷酶反應的正向進行.

圖4 腺嘌呤N3原子與Curcin和Curcin C活性位點處Arg的距離測量示意圖

4 討 論

相較于先前的實驗，本次研究所采用的蛋白質結構預測軟件trRosetta預測得到的Curcin和CurcinC模型的質量更高，PROCHECK評估結果顯示Curcin和CurcinC位于不可信區域以外的氨基酸占比分別為99.6%和100%(之前研究中Curcin和Curcin C的占比分別為98.1%和97.8%).此外，兩個蛋白模型都通過了Qmean的質量評估(之前研究中Curcin和Curcin C都未通過).這表明本次實驗所使用的三級結構質量更高，使用該模型進行后續分析得到的結論也應該更具有說服力.本次研究還加入了活性位點預測的步驟，活性位點是小分子配體與受體結合的位置，該位置的確定能夠進一步限制對接空間，有效降低了小分子配體在活性位點之外結合的概率，進而提高對接結果的精確度.此外，本次實驗不僅考慮了反應后受體與配體的相互作用，即腺嘌呤與Curcin及Curcin C的相互作用，還考慮了反應前受體與配體之間的相互作用，將腺苷與兩種RIPs進行了分子對接，分析了造成Curcin與Curcin C N-糖苷酶活性差異的可能原因，從N-糖苷酶機制入手對活性位點處的關鍵氨基酸進行了分析.

從對接結果中我們發現，Curcin和Curcin C與腺苷之間的結合能普遍低于腺嘌呤，通常情況下結合能越低產物越穩定，這就意味著Curicn與Curcin C更容易與腺苷相結合.理論上，在RIPs發揮脫嘌呤作用時結合位點結合的底物應該是完整的腺苷，糖苷鍵斷裂后形成才形成了腺嘌呤與RIP的復合體，隨后腺嘌呤從結合口袋中脫落，RIP再與其它RNA的腺苷結合進行下一次的催化.這就意味著在RIP催化N-糖苷酶反應的過程中腺嘌呤與腺苷之間存在一種競爭抑制的關系，如果RIP與腺苷之間的結合能低于腺嘌呤則有利于反應的正向進行，若兩者的結合能相近則會阻礙下一次反應的開始.Curcin與腺嘌呤及腺苷的結合能相差0.73 KJ/mol，Curcin C與腺嘌呤和腺苷之間的結合能相差0.89 KJ/mol，可以看出Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間結合能的差異更加明顯，這可能會導致腺苷在與腺嘌呤競爭Curcin C的活性位點時更加占據優勢，進而提升了Curicn C的N-糖苷酶活性.

Frankel等人利用x射線結構指導了一系列Ricin的定向突變實驗,他們發現Arg和Glu在RIPs發揮N-糖苷酶作用的過程中起著非常重要的作用[11].當Ricin中Arg 180轉化為Gln時(R180Q)N-糖苷酶活性會降低2500倍，Glu 177轉化為Gln(E177Q)活性降低至少170倍.這與Arg的質子化作用有關，研究表明，質子化作用可以明顯降低N-糖苷鍵離子解離通道所需要的能量，降低其水解所需的活化能，穩定水解產物，極大的促進N-糖苷鍵的水解.RIP在與底物結合時,Arg就可以使腺苷的N3原子質子化，從而促進了N-糖苷鍵的水解.當N-糖苷鍵斷裂后，腺嘌呤環上會聚集負電荷，堿基會聚集正電荷，Arg的質子化作用恰好可以中和腺嘌呤上的負電荷，Glu則促使水分子水解，水解產物氫氧根離子平衡堿基上的正電荷，最終達到使產物穩定的作用[12].從受體與配體之間的結合方式來看，Curcin在與兩種配體互作時都缺少一個關鍵氨基酸Arg的參與,測量結果顯示Curcin活性位點處Arg與腺嘌呤之間的距離要遠于Curcin C.因此，Arg在Curcin和Curcin C活性位點處所處的位置也是造成兩者N-糖苷酶活性差異的重要原因.

最終通過對接結果的比較分析，我們找到了三個可能造成Curcin C擁有更強N-糖苷酶活性的潛在原因.1.Curcin C與腺嘌呤及腺苷的結合能都要低于Curcin；2.Curcin與腺嘌呤結合時，活性位點處的Arg與腺嘌呤的N3原子距離較遠，不利于質子化作用，不利于N-糖苷鍵的水解；3.Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的結合能差異更大，腺苷相較于腺嘌呤對活性位點具有更強的競爭力，有利于Curcin C在反應結束后快速參與到下一次反應中.