銀杏葉提取物對高脂飲食誘導肥胖犬脂肪沉積及脂質代謝的影響

陸 江，盧勁曄，周紅蕾

（江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院，江蘇泰州 225300）

犬的肥胖癥是由脂肪細胞肥大引起的，嚴重危害寵物犬的健康（郭世洪，2020）。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）可調控脂肪細胞分化與成熟（Lee等，2018），腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號通路可抑制脂肪酸合成（Mariangela等，2016），均與脂肪代謝有關。銀杏葉中富含多種活性成分，具有降壓、降脂、抗氧化等功效（王森等，2021）。但在脂肪沉積和脂質代謝機制等方面的研究尚少，作用機制也不清晰。因此，本研究基于PPARγ與AMPK信號通路探討銀杏葉提取物對犬肥胖脂肪沉積和脂質代謝的影響，為銀杏葉干預防治犬肥胖癥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料泰迪型貴賓犬，雄性，3歲，體重5.5 kg左右，飼養于江蘇農牧科技職業學院試驗犬舍。銀杏葉提取物購于泰州市中醫院?；A飼糧（粗蛋白質≥24.5%，粗脂肪≥13.0%，粗纖維≤5.0%）購于上海比瑞吉寵物用品股份有限公司。

1.2 試驗方法30只貴賓犬（泰迪型）適應性飼養1周后隨機分成5組，分別為正常飼糧對照組（CD組）、高脂飼糧組（HFD組）、低劑量銀杏葉提取物組（LGL）、中劑量銀杏葉提取物組（MGL）和高劑量銀杏葉提取物組（HGL）。CD組飼喂基礎飼糧，HFD組飼喂高脂飼料（基礎飼糧+25%豬油），各銀杏葉提取物飲食組分別飼喂含1%、3%和5%銀杏葉提取物的高脂飼料，試驗為期8周。試驗結束后第2天空腹采血分離血清，然后麻醉，迅速取腹部皮下脂肪組織，部分保存于10%中性福爾馬林溶液，另一部分保存于液氮中，后轉移-80℃冰箱中保存。

1.3 體重及體脂率測定試驗結束后用寵物電子稱測定犬的體重，用EchoMRI體成分分析儀測定體脂率。

1.4 血液生化檢測用試劑盒測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，所有檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 HE染色檢測皮下脂肪組織中脂肪細胞大小蘇木精-伊紅（H&E）染色如下：從福爾馬林溶液中取出樣品，脫水并包埋在石蠟中，脫水，包埋在石蠟中，HE染色，中性膠密封。在普通顯微鏡下觀察圖像并保存紀錄，使用Image J軟件計算細胞橫切面面積。

1.6 qRT-PCR檢測脂肪組織中脂質代謝相關因子基因表達用TRIzol法提取脂肪組織總RNA，通過逆轉錄合成cDNA，并用于實時熒光PCR擴增。靶基因的引物序列根據已發表的Gen Bank設計（表1）。以 β-肌動蛋白（β-actin）為內參基因，PCR擴增35個循環：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s。每個樣本進行3次平行，目的基因mRNA的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

表1 PCR引物序列

1.7 western blot檢測脂肪組織中脂質代謝相關因子蛋白表達用RIPA裂解液提取皮下脂肪組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進行SDS-PAGE電泳2 h，PVDF膜轉膜2 h，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。按1∶2 000加兔抗Ⅰ抗AMPKα1、ACC1、CPT-1、SREBP-1、FAS、PPARγ 和 GAPDH，置于4℃搖床中孵育過夜，TBST洗膜3次。加兔抗辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗（1∶5000）室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次?；瘜W發光成像儀中顯影成像。所有抗體均購自Abcam公司。以GAPDH為內參，采用Image J分析軟件對各組條帶的光密度值進行分析，試驗重復3次，取平均值。

1.8 數據處理試驗結果用“平均值±標準差”表示，兩組數據用SPSS 23.0軟件t檢驗進行比較。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果

2.1 銀杏葉提取物對體重、體脂率及脂肪細胞大小的影響由表2可知，HFD組體重和體脂率均顯著高于CD組，MGL組和HGL組的體重和體脂率均顯著低于HFD組（P＜0.05），MGL組、HGL組脂肪細胞面積小于HFD組（P＜0.05）。

表2 銀杏葉提取物對體重、體脂率及脂肪細胞大小的影響

2.2 銀杏葉提取物對血脂代謝指標影響 由表3可知，與CD組相比，HFD組TG、TC及LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜ 0.05）。與 HFD組比較，MGL組 TG、LDL-C及HDL水平與HFD組差異顯著（P＜0.05），HGL組TG、TC、LDL-C及HDL- C水平與HFD組差異顯著（P＜0.05）。

表3 銀杏葉提取物對血脂代謝指標影響 mmol/L

2.3 銀杏葉提取物對脂肪組織中脂質代謝相關基因表達的影響由表4可知，與HFD組比較，不同劑量銀杏葉提取物均顯著提升AMPK α1的mRNA表達水平（P＜0.05）；MGL組和HGL組的 ACC-1、SREBP-1、FAS及 PPARγ 的 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），CPT-1的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 銀杏葉提取物對脂肪組織中脂質代謝相關基因表達的影響

2.4 銀杏葉提取物對脂肪組織中脂質代謝相關蛋白含量影響由圖1可知，與HFD組比較，LGL組CTP-1蛋白表達顯著上調（P＜0.05），FAS蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；MGL組和HGL組AMPK α1及CPT-1蛋白表達顯著上調（P ＜ 0.05），ACC1、SREBP-1、FAS及 PPARγ蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。

圖1 銀杏葉提取物對脂肪組織中脂質代謝相關蛋白含量影響

3 討論

研究表明，長期的能量攝入大于消耗會造成脂肪大量沉積，進而導致肥胖（Fu等，2016）。長期攝入脂肪能量高飼料會引起肥胖，因此，高脂飲食是動物肥胖癥造模的主要方法（Grant等，2011）。在本研究中，HFD組體重、體脂率及脂肪細胞面積顯著升高，表明高脂飼料是誘導犬肥胖的有效方法。給予銀杏葉提取物干預后可減輕脂肪細胞肥大，改善犬肥胖指標。

AMPK信號通路是調節脂質代謝的重要通路。AMPKα1可通過抑制下游脂質代謝相關酶ACC-1、FAS和SREBP-1的表達，發揮抑制脂質合成作用（樸穎等，2022），還可激活下游分子脂肪酸β氧化關鍵酶CTP-1的表達，促進脂肪分解（單甄真等，2019）。本研究結果顯示，銀杏葉提取物可顯著上調AMPK α1和CTP-1表達，顯著下調ACC-1、FAS和SREBP-1表達。提示銀杏葉提取物可激活AMPK信號通路，減少高脂飲食誘導犬脂質積聚。

PPARγ具有促進前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞的作用，并可促進脂滴的形成（Fu等，2018）。本研究中高脂飲食可顯著上調PPARγ的表達，銀杏葉提取物干預后可逆轉PPARγ的表達。提示抑制PPARγ的表達，減少前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化和脂質沉積也可能是銀杏葉提取物的作用機制。

4 結論

銀杏葉提取物能改善犬的肥胖癥狀，降低血脂，減少脂肪組織脂質沉積。其作用機制可能與銀杏葉提取物激活AMPK信號通路，抑制PPARγ信號通路有關。