基于晝夜節律的阿霉素誘發大鼠腎病模型優化研究

白石磊，孟香花，陳玉花，肖田梅，包桂花，青 順，馬海燕，白梅榮

（1.錫林郭勒盟蒙醫醫院，內蒙古 錫林浩特 026000；2.內蒙古民族大學蒙醫藥研發工程教育部重點實驗室，內蒙古 通遼 028043；3.內蒙古民族大學化學與材料學院，內蒙古 通遼 028043）

生物節律是指機體各個臟器具有的節律性變化。人的健康和發病均與相關臟器晝夜節律的正常與否有關?？梢?，腎臟、利尿和水通道相關指標分泌或排泄功能也應該具有晝夜節律［1-2］。蒙醫學認為，腎臟居于巴達干之位，為調節體內水液的臟器，也是病變巴達干、赫依之道；晚上時間稱為涼辰，在此時間段機體中巴達干蓄積，赫依運行，希拉趨于正常。因此，若選擇巴達干生物節律中偏盛時刻，寒性阿霉素染毒大鼠更容易使巴達干和赫依偏盛，與希拉相搏，造成 “三根” 之間協調關系而引起腎臟功能紊亂。筆者為探討阿霉素誘導腎病是否有晝夜節律，以阿霉素為造模劑，以大鼠為研究對象，分別設置早（8：00）和晚（8：00）兩個造模時間點，以尿量和利尿相關指標為評價因素，闡釋阿霉素誘導腎病模型晝夜節律，明確阿霉素最佳造模時間，以期為明確蜀葵花和冬葵果等利尿作用蒙藥最佳給藥時間奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，由億斯（長春）實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（吉-2015-0005）。

1.1.2 藥品與試劑

阿霉素（北京酷萊博公司提供，批號：25316-40-9）；生理鹽水抗利尿激素（ADH）、心房鈉尿肽（ANP）、醛固酮（ALD）、水通道蛋白1（AQP1）、水通道蛋白2（AQP2）試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司提供，批號：JM-02197R1、JM-01961R1、JM-10735R1、JM-01884R1、JM-01886R1）；環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司，批號：MM-0549R1、MM-0027R1）。

1.1.3 實驗儀器

代謝籠；型酶標儀（SUNRISE）；離心機（TG16-WS）。

1．2 實驗方法

1.2.1 動物分組

將32只SD大鼠按體重隨機分為早和晚正常組、早和晚模型組等4組，每組8只。

1.2.2 造模處理

大鼠在實驗室代謝籠中適應3天，篩選課題組前期研究的阿霉素給藥劑量6.5 mg·kg-1，于造模第1天和第8天尾靜脈分別注射4.0 mg·kg-1和2.5 mg·kg-1阿霉素溶液制備大鼠腎病模型。從造模開始觀察大鼠一般狀態及尿量。

1.2.3 動物處理

在造模的第1、14、28天分別收集24 h尿液和從尾靜脈取血，3 000 r·min-1離心分離血清，觀察尿量及相關血清指標的動態變化，于實驗第28天，以10%水合氯醛溶液麻醉各組大鼠，取腎臟，計算腎臟指數。

1．3 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2．1 一般觀察

與正常組比較，模型組從造模第2天開始個別大鼠出現腹瀉，精神狀態萎靡，毛發光澤變差、脫毛等現象；從第5天開始個別大鼠出現紅色尿，食欲不振，體重增長緩慢；從第8天開始個別大鼠出現尾巴潰爛現象，但無死亡現象。

2．2 腎臟指數變化

與早正常組比較，早模型組大鼠腎臟指數有上升趨勢，但差異無顯著；與晚正常組比較，晚模型組大鼠腎臟指數上升，差異顯著（P＜0.05）；與早模型組比較，晚模型組大鼠腎臟指數上升，具有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數變化（±s，n=8）Tab. 1 Changes of renal index in each group (±s，n=8)

表1 各組大鼠腎臟指數變化（±s，n=8）Tab. 1 Changes of renal index in each group (±s，n=8)

注：與晚正常組比較* P＜0．05；與早模型組比較△P＜0．05。

images/BZ_51_304_1612_2208_1754.png

2．3 各組造模的第1天、第14天和第28天24 h尿量比較

分別與早、晚正常組比較，早、晚模型組大鼠造模第1 天、第14 天和第28 天尿量均下降顯著（P＜0.05）；與早模型組比較，晚模型組第28天時尿量下降明顯，具有顯著性差異（P＜0.05）。提示，晚模型組優于早模型組。見表2。

表2 各組造模第1天、第14天和第28天24 h尿量比較（±s，n=8）Tab. 2 Comparison of 24 h urine volume in each group on the 1st, 14th and 28th day after modeling (±s，n=8)

表2 各組造模第1天、第14天和第28天24 h尿量比較（±s，n=8）Tab. 2 Comparison of 24 h urine volume in each group on the 1st, 14th and 28th day after modeling (±s，n=8)

注：與早正常組比較◆P＜0．05；與晚正常組比較*P＜0．05；與早模型組比較△P＜0．05。

images/BZ_51_304_2308_2208_2379.png3.95±1.51*3.22±1.1*2.2±0.96*△第1天第14天第28天9.48±3.50 6.05±2.25 5.32±1.05 3.86±0.56◆3.17±0.59◆3.72±1.04◆6.87±2.54 5.64±2.25 5.12±0.79

2．4 各組大鼠造模第1天、第14天和第28天時血清生化指標含量變化

與早正常組比較，早模型組造模第1 天，血清cGMP 含量顯著下降（P＜0.05），晚正常組血清ALD、cGMP、AQP2 含量明顯下降（P＜0.05）；與晚正常組比較，晚模型組造模第1 天，血清ADH、ALD、cAMP、AQP1 及AQP2 含量上升顯著（P＜0.05）。與早模型組比較，晚模型組血清cGMP、AQP1 含量上升顯著（P＜0.05）。提示，晚模型具有優于早模型趨勢，模型具有一定的晝夜規律趨勢。見表3。

表3 各組造模第1天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 3 Changes of serum indexes in each group on the 1st day after modeling (±s，n=8)

表3 各組造模第1天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 3 Changes of serum indexes in each group on the 1st day after modeling (±s，n=8)

注：與早正常組比較◆P＜0．05；與晚正常組比較*P＜0．05；與早模型組比較△P＜0．05。

組 別早正常組早模型組晚正常組晚模型組AQP2/（pg·mL-1）323.24±29.92 334.06±27.61 285.81±8.34◆341.87±19.46*ADH/（pg·mL-1）7.90±0.53 8.28±0.06 7.37±0.34 9.48±0.48*ANP/（pg·mL-1）321.12±6.25 336.18±20.49 334.19±5.38 365.71±22.54 ALD/（pg·mL-1）308.52±25.80 299.92±15.28 267.70±21.67◆308.77±19.90*cAMP/（nmol·L-1）7.51±0.28 7.27±0.27 6.82±0.73 8.21±0.10*cGMP/（nmol·L-1）9.89±0.69 8.44±0.11◆7.77±0.17◆11.26±0.50△AQP1/（pg·mL-1）648.34±17.70 653.15±14.73 632.79±17.14 695.25±32.96*△

與早正常組比較，早模型組造模第14天，血清ADH含量上升顯著（P＜0.05），晚正常組血清cAMP和AQP2 含量下降顯著（P＜0.05）；與晚正常組比較，晚模型組造模第14 天，血清ADH、ALD、AQP1 及AQP2含量上升顯著（P＜0.05）；與早模型組比較，晚模型組血清ADH、ALD、AQP1 及AQP2 含量上升顯著（P＜0.05）。提示，晚模型優于早模型，模型具有明顯的晝夜規律。見表4。

表4 各組造模第14天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 4 Changes of serum indexes in each group on the 14th day after modeling (±s，n=8)

表4 各組造模第14天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 4 Changes of serum indexes in each group on the 14th day after modeling (±s，n=8)

注：與早正常組比較◆P＜0．05；與晚正常組比較*P＜0．05；與早模型組比較△P＜0．05。

早正常組早模型組晚正常組晚模型組AQP2/（pg·mL-1）329.76±28.97 299.33±27.12 311.03±14.79◆344.73±18.08*△組別ADH/（pg·ml-1）10.30±0.36 11.16±0.24◆11.02±0.59 12.89±0.29*△ANP/（pg·mL-1）289.13±13.36 287.54±33.40 246.20±11.77 299.67±15.20 ALD/（pg·mL-1）308.77±18.43 307.54±10.13 294.73±21.04 337.34±22.59*△cAMP/（nmol·L-1）8.36±0.75 7.03±0.42 7.53±0.36◆7.71±0.46 cGMP/（nmol·L-1）14.25±0.62 14.39±1.86 12.95±0.70 15.16±1.28 AQP1/（pg·mL-1）512.30±32.07 458.98±12.19 508.69±14.50 538.59±25.56*△

與早正常組比較，早模型組造模第28天，血清ANP、AQP1、AQP2含量上升顯著（P＜0.05），晚正常組血清ALD 含量下降顯著（P＜0.05）；與晚正常組比較，晚模型組造模第28 天，血清ADH、ALD、cAMP、AQP1 及AQP2 含量上升顯著（P＜0.05）；與早模型組比較，晚模型組血清ALD 含量下降顯著（P＜0.05），cAMP含量上升顯著（P＜0.05）。提示，此時模型組無明顯晝夜規律。見表5。

表5 各組造模第28天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 5 Changes of serum indexes in each group on the 28th day after modeling (±s，n=8)

表5 各組造模第28天血清指標變化（±s，n=8）Tab. 5 Changes of serum indexes in each group on the 28th day after modeling (±s，n=8)

注：與早正常組比較◆P＜0．05；與晚正常組比較*P＜0．05；與早模型組比較△P＜0．05。

組別早正常組早模型組晚正常組晚模型組AQP2/（pg·mL-1）335.71±12.51 363.58±9.01◆321.63±13.16 351.79±15.22*ADH/（pg·mL-1）8.42±0.31 9.04±1.02 8.16±0.29 9.07±0.35*ANP/（pg·mL-1）308.36±16.63 367.32±12.46◆322.87±18.31 360.78±24.28 ALD/（pg·mL-1）288.89±32.96 343.71±48.35 269.62±18.59◆301.66±16.64*△cAMP/（nmol·L-1）7.46±0.32 8.10±0.27 7.32±0.15 8.44±0.11*△cGMP/（nmol·L-1）10.53±0.16 12.14±1.13 10.97±0.21 11.51±0.55 AQP1/（pg·mL-1）661.61±43.66 741.65±76.24◆657.75±37.41 734.00±25.34*

綜合分析造模第1天、第14天及第28天尿量及ADH、ALD、AQP1及AQP2分泌和釋放變化可知，晚模型組造模效果最好。

3 討論

課題組在前期研究中，采用阿霉素（4.0+1.0）mg·kg-1、（4.0+1.5）mg·kg-1、（4.0+2.0）mg·kg-1、（4.0+2.5）mg·kg-14個劑量間隔1周2次重復尾靜脈注射誘導腎臟病變后發現，（4.0+2.5）mg·kg-1尿液及利尿相關指標穩定性強于其他模型組。因此，本研究在前期研究基礎上，依據腎臟功能晝夜規律，阿霉素早上和晚上（4.0+2.5）mg·kg-1劑量的兩個造模時間點進行造模，獲得了縮短造模周期到14天的較好實驗結果。

晝夜規律與人體的體溫、心率、激素、酶等的變化密切相關，同時對藥物的吸收、分布、代謝、排泄等有一定影響［3］。ADH是促進腎臟對水的重吸收的一種激素，它是調節體液平衡的關鍵性因素［4-5］。大量研究表明，AQP1和AQP2是參與ADH促進腎臟水代謝的主要因子，機體內大部分水分的重吸收均與AQP2水通道作用有關，AQP2對維持機體水平衡起著重要作用［6-7］。ALD由腎上腺皮質球狀帶分泌和合成，促進鈉在體內潴留，同時排出鉀離子到體外［8］?？梢?，ADH、ALD、AQP1和AQP2均參與腎臟水重吸收，其分泌增加則均可使鈉和水重吸收增加，尿液排泄量減少。本實驗結果表明，造模第1天時，晚模型組除了尿量顯著減少外，ADH、ALD、AQP1 及AQP2 分泌和釋放明顯高表達，且其中cGMP、AQP1 分泌和釋放明顯高于早模型組；造模第14天時，晚模型組除了尿量持續顯著減少以外，ADH、ALD、AQP1及AQP2分泌和釋放持續高于早模型組；造模第28天時，晚模型組除了尿量持續顯著減少以外，ADH、AQP1及AQP2分泌和釋放均接近于早模型組。本實驗結果提示，正常機體尿液排泄和水重吸收相關指標具有明顯的晝夜規律；阿霉素誘導大鼠早、晚尿液及水重吸收相關指標也有晝夜規律，但阿霉素誘導腎病的晝夜規律周期為14天，14天內晚模型組大鼠的尿量顯著減少且ADH、ALD、AQP1及AQP2分泌顯著升高。

總之，綜合分析尿量和血清生化指標實驗結果可見，晚8 時間隔1 周2 次重復尾靜脈注射阿霉素6.5（4.0+2.5）mg·kg-114天內可獲得穩定可重復的大鼠腎病模型。該研究為蜀葵花等利尿藥物給藥方案的確定提供模型基礎的同時，探索了動物模型中結合晝夜規律理念的新思路。因此，該研究具有一定的科學價值。