腹腔鏡袖狀胃切除術經腸-肝軸對肥胖患者NAFLD的影響

何亞偉 陳皖京 于 剛 程云生 汪 泳

肥胖是一種由于各種環境和生理因素改變使得機體內出現能量代謝不平衡從而導致脂肪異常堆積的病理狀態，已逐漸成為我國醫療體系所面臨的重大挑戰。目前認為，糖尿病、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)等疾病的發生與肥胖都有著密不可分的聯系。其中NAFLD已經成為全球范圍內其他肝臟相關疾病的主要原因，并可能成為終末期肝病的主要誘發因素[1]。相關研究[2]顯示，腸道微生物群落參與了NAFLD患者肝臟脂肪變性和纖維化的發生與發展，細菌源性產物進入門脈循環可以誘導先天性免疫的觸發，導致大量炎癥因子釋放，促進肝臟炎性病變。目前認為，腸-肝軸(腸道、微生物群和肝臟通過門靜脈循環相互交流的復雜網絡)在肝臟疾病的發展及預后中可能具有一定的作用。然而在肥胖患者中，長期不良飲食習慣導致的腸道菌群失調以及體內脂肪異常堆積也是極為常見的問題。因此研究減重手術對肥胖患者腸道菌群、NAFLD的影響，以及腸-肝軸在其中調節作用的機制具有重要意義。減重代謝手術是目前國內外公認的可以迅速、有效、長期治愈病態性肥胖的方法。Yeo等[3]的研究表明，減肥手術可以減輕體質量的同時改善NAFLD纖維化。另有研究[4]發現，利拉魯肽可以改善肝臟脂肪變性，其機制可能是通過下調腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)等炎性介質的表達來實現的。但目前減重手術對肥胖患者腸道菌群和NAFLD的影響、兩者的相互關系以及腸-肝軸的調節機制尚不完全清楚。因此，本研究比較了腹腔鏡袖狀胃切除術前后肥胖患者脂肪肝、血清炎癥因子以及腸道菌群的變化情況，以探究減肥手術引起的腸道菌群的變化對肥胖患者NALFD改善的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年7月至2021年1月在安徽醫科大學第二附屬醫院胃腸與減重代謝外科就診并接受LSG治療的30例肥胖合并NAFLD患者為研究對象，其中男性11例，女性19例，年齡18～49歲，平均 (31.60±7.66)歲，身體質量指數(body mass index，BMI)33.21～62.10 kg/m2，平均(43.90±22.98)kg/m2。納入標準：①BMI≥32.5 kg/m2；②年齡為16～65歲；③根據2001年中華肝臟病學會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的非酒精性脂肪診斷標準[5]，患者經過腹部超聲檢查符合NAFLD診斷;④排除手術禁忌后均接受統一減重術式——腹腔鏡袖狀胃切除術。排除標準：①術前存在長期大量飲酒史或正處于急慢性病毒性肝炎狀態或有嚴重的其他肝臟疾??； ②術前常規檢查提示存在感染和/或嚴重疾病不能耐受手術；③臨床資料不完整。剔除標準：術后合并有手術相關并發癥。本研究過程均已告知患者，并取得患者本人或其委托人的書面同意，且獲得安徽醫科大學第二附屬醫院倫理委員會的批準[倫理審批文件號：YX2021-017(F1)]。

1.2 研究方法 所有患者入院后完善常規檢查并留取血液、糞便標本，排除明顯手術禁忌癥后予以行統一減肥術式—腹腔鏡袖狀胃切除術，術后3個月完善患者隨訪資料并再次留取血液及糞便標本，對比分析術前和術后3個月的臨床資料，進行血清炎癥因子與肝臟評分的相關性分析。

1.3 觀察指標

1.3.1 體質量參數 分別于術前和術后3個月于我院門診由我科病案管理師記錄患者身高、體質量、腰圍，并計算BMI。

1.3.2 實驗室指標 分別于術前及術后第3個月清晨空腹狀態抽取患者靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，以4 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液保存在-80℃冰箱待用。采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中TNF-a、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)、IL-4水平。采用化學發光免疫法分析三酰甘油(triacylglycerol, TG)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase, AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-gamma-glutamyltransferase, γ-GGT)水平。采用流式細胞術測定血小板(platelet, PLT)含量。

1.3.3 糞便菌群16S核糖體RNA基因測序 16S rRNA擴增子測序由Genesky生物技術公司(上海，中國)完成。使用FastDNA?SPIN試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)提取糞便總DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，使用Nanodrop 2000和Qubit3.0分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)檢測基因組DNA的濃度和純度。用以下引物擴增16S rRNA基因V3-V4高變區:341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’); 805R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)。測序使用Illumina NovaSeq 6000測序儀(San Diego, California, USA)。

2 結果

2.1 手術前后人體測量學及一般實驗室指標變化 手術后3個月隨訪資料顯示，患者的BMI、體質量、腰圍、AST、ALT、GGT、TG、TC等在術后3個月均降低，且差異有統計學意義(P<0.05)，PLT手術前后差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 術前和術后3個月體質量參數及一般實驗室指標

2.2 LSG術前后炎癥因子水平、FLI、FIB-4評分比較 LSG術后3個月，患者血清IL-4較術前上升，而 IL-1β和TNF-a均較術前下降，FLI和FIB-4評分低于術前，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 術前和術后3個月炎癥因子與肝臟評分

2.3 LSG術前后腸道菌群的變化及與炎癥因子及其相關性 術后3個月腸道菌群分析顯示擬桿菌[(0.536±0.115)(術前)比(0.577±0.072)(術后),P=0.360]和梭桿菌[(0.007±0.013)(術前)比(0.034±0.045)(術后),P=0.046]數量增加，厚壁菌[(0.118±0.089)(術前)比(0.051±0.033)(術后),P=0.036]、變形菌[(0.078±0.089)(術前)比(0.065±0.087)(術后),P=0.757]數量減少(圖1A),患者腸道菌群alpha多樣性增加[(3.62±0.46)(術前) 比(3.92±0.52)(術后),P=0.122]。見圖1B。術前細胞因子與微生物的Spearman相關性分析顯示，梭桿菌與TNF-a(r=-0.203,P=0.031)，IL-1β(r=-0.329,P=0.023)呈負相關，β-變形菌與IL-1β(r=0.065,P=0.798)呈正相關，與IL-4(r=-0.128,P=0.613)呈負相關，厚壁菌與TNF-a(r=-0.315,P=0.033)呈負相關，與IL-1β(r=0.459,P=0.046)呈正相關(圖1 C)。

注：A，手術前后部分腸道菌群的變化趨勢；B，術前和術后3個月腸道菌群Alpha多樣性的變化；C， 細胞因子與菌群的Spearman相關性分析。

2.4 術前術后炎癥因子與FLI、FIB-4評分的相關性 術前相關性分析顯示FIB-4與IL-1β(r=0.373，P=0.043)、TNF-a(r=0.435，P=0.016)呈正相關，與IL-4呈負相關(r= -0.410，P=0.024)；FLI與IL-1β(r=0.402，P=0.028)、TNF-a(r=0.391，P=0.033)呈正相關，與IL-4呈負相關(r=-0.523，P=0.003)。見圖2。術后FIB-4與IL-1β(r=0.382，P=0.037)、TNF-a(r= 0.413，P=0.023)呈正相關，與IL-4呈負相關(r=-0.425，P=0.019)；FLI與IL-1β(r=0.362，P=0.049)、TNF-a(r= 0.363，P=0.048)呈正相關，與IL-4呈負相關(r=-0.426，P=0.019)。見圖3。

圖2 術前細胞因子與肝臟評分的相關性分析

圖3 術后細胞因子與肝臟評分的相關性分析

3 討論

在全球范圍內，肥胖和超重的人數呈現出急劇增加的趨勢，其導致的心血管疾病、NAFLD等的風險也隨之增加。其中NAFLD已成為世界上最常見的慢性肝病之一，它被定義為一系列由肝臟脂肪變性引發的肝臟病理變化，并可能會發展為肝臟壞死性炎癥和纖維化[8]。肥胖患者由于飲食習慣的改變多有腸道菌群失調表現，腸道菌群的紊亂可導致腸道屏障功能受損，而腸道菌群是其與宿主相互作用的統一體，因此菌群紊亂能夠導致機體生態失調。雖然腸道菌群對人體的作用已被證實，但在NAFLD中，菌群與宿主相互作用的機制并不完全清楚，因此本研究的目的是探索LSG手術引起的腸道菌群的變化對肥胖患者NALFD改善的可能機制。

腸道菌群主要由4個門組成:厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，包括1 000余種微生物，其中約90%的菌群屬于厚壁菌門和擬桿菌門，厚壁菌門/擬桿菌門的比值被認為是影響腸道菌群紊亂的重要因素。研究[9]表明，NAFLD患者的腸道微生物群有顯著的改變，這與本研究結果相同。同時，紊亂的腸道菌群可以通過增加腸道通透性和激活免疫反應來促進NAFLD的發病和進展[10]。有研究[11]認為，許多效應是由共生細菌產生的活性代謝產物介導的，這些代謝產物能夠參與調節NAFLD的生理和病理過程。腸道環境的紊亂和菌群的失衡程度與脂肪肝的嚴重程度呈正相關[12]，與本研究一致，即NAFLD患者微生物群落的紊亂與炎癥因子具有顯著相關性，而且炎癥因子與FLI、FIB-4評分呈現顯著相關。此外腸道菌群的改變和腸道通透性的增加導致了肝臟與腸源性細菌接觸機會的增加，其釋放的大量促炎因子既可以參與脂質調節和NAFLD的發病，又可以通過門靜脈迅速轉移到肝臟，誘導肝臟炎癥和纖維化，促進相關腸-肝軸的改變，加速NAFLD的發展[13]。Ruiz等[14]的研究顯示，高脂飲食喂養再進行抗脂肪處理的大鼠血清促炎因子如IL-1β、 TNF-α水平降低，而抗炎因子IL-4水平升高，這與本研究中患者袖狀胃術后炎癥因子變化一致，同時其對該組大鼠肝臟解剖發現脂肪沉積較單純高脂喂養的大鼠明顯減輕，這與本研究對肝臟相關評分的變化相同。此外，Das等[15]的研究得出輕度纖維化和中度纖維化患者血清IL-1β、TNF-a、IL-4之間差異明顯，這說明這些炎癥因子與肝臟纖維可能存在一定程度的相關性，這與本研究結果一致。相關研究[16]表明， IL-1β, TNF-a等炎性因子的過表達能夠激活肝臟星狀細胞以及其它相關細胞的活動，如Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原細胞，從而增強細胞外基質的表達，啟動肝臟纖維化并加速纖維形成，而IL-4則可以對多種肝損害起到保護作用。研究[17]表明，IL-4可以激活M2型巨噬細胞，參與組織重塑和免疫調節進程，從而改善肝臟纖維化，而IL-1β和TNF-a等又可以上調M1巨噬細胞的表達，導致M1/M2極化，從而誘導肝臟脂肪堆積及炎性改變，該過程可能與CaMKK β/ AMPK通路介導的M1/M2去極化被抑制有關。IL-1β和TNF-a也可以通過磷酸化核轉錄因子C/EBPβ Thr235來上調11β-HSD1的表達，而 11β-HSD1可以與下游肝臟等多種受體結合影響脂質代謝，促進高血脂、脂肪肝等的發生[18]。

本研究中，LSG可改善肥胖患者腸道菌群豐度及分布，同時也可以改善NAFLD，這可能與體內腸道菌群的改變介導的炎癥介質水平的變化有關，因此對于NAFLD患者可適當予以益生菌的補充來改善腸道菌群，從而調節炎癥水平來改善肝脂肪變性和纖維化的發展。然而本研究存在一定局限性，一是隨訪時間較短，無法對術后患者菌群改變的長期效應以及其對NAFLD改善的長期效果進行評估；二是樣本量小，后續有待改進；三是未能對腸道菌群影響NAFLD發生發展的具體生理病理機制進行揭示。

綜上所述，LSG可以改善肥胖人群腸道菌群分布及豐度，降低了炎癥因子水平，改善了炎癥因子介導的肝臟相關損害，這對病態性肥胖患者的NAFLD的治療具有一定的臨床指導意義。