色素上皮衍生因子對視網膜X 射線損傷的保護作用

朱 冉 丁伯洋 李文艷 李 婕 劉芬菊 陳新建 俞家華

1（蘇州大學蘇州醫學院放射醫學與防護學院 蘇州 215123）

2（放射醫學與輻射防護國家重點實驗室 蘇州 215123）

3（蘇州大學電子信息學院 蘇州 215006）

色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）是由418 個氨基酸組成的分泌型糖蛋白，分子量為50 kDa，屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族成員，因首次在視網膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）細胞中被發現而得名，其在心、腦、肝、腎、肺、骨等組織廣泛表達，具有多種活性功能，如營養神經、抗血管生成、抗氧化、抗炎癥與抗腫瘤功能［1-4］。在動物模型中發現敲除PEDF可加重誘導性和遺傳性的視網膜變性［5］，體內外實驗也表明外源性給予PEDF可以有效保護RPE細胞和感光細胞［6-7］，說明眼部的PEDF 對于維持視網膜的正常功能、抵御外界損傷因素具有重要作用。

放射性視網膜病變常見于葡萄膜黑色素瘤與鼻咽癌放療后，是導致患者視力損傷和眼球萎縮的重要原因，主要的病理學改變是血管內皮細胞損傷、黃斑水腫、視網膜變性壞死，目前尚無特異性療法，臨床主要治療手段是采用糖皮質激素抗炎與抗血管生成因子，但對于視力損傷的療效并不理想［8-9］。本研究旨在研究PEDF 對視網膜輻射損傷的作用，我們選用了人RPE 細胞ARPE-19，在抑制PEDF功能后檢測了X射線對ARPE-19細胞的損傷作用，接著分析了PEDF 上第44～77 位的34 個氨基酸片段（PEDF-34）對視網膜X 射線損傷的保護作用。本實驗結果能為臨床防治放射性視網膜病變提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

杜氏改良Eagle：F12 培養基（DMEM：F12）（美國Hyclone）；胎 牛 血 清（FBS）（以 色 列BI）；Atglistatin（ATG）（美 國Selleck）；溴 烯 醇 內 酯（Bromoenol lactone，BEL）（美國Sigma）；CCK-8 試劑盒與蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Lipofectamine RNAiMAX Reagent（美國Invitrogen）；PEDF siRNA(siRNA1：正義 鏈5'-GCGAACAGAAUCCAUCAUUTT-3'，反 義鏈 5'-AAUGAUGGAUUCUGUUCGCTT-3'；siRNA2： 正 義 鏈 5'-GCAGUGGGUAACAAAGUUUTT-3'，反 義 鏈5'-AAACUUUGUUACCCACUGCTT-3'；siRNA3：正義鏈5'-CCGGAAGCAUGAGUAUCAUTT-3'，反 義 鏈5'-AUGAUACUCAUGCUUCCGGTT-3'；陰 性 對 照siRNA： 正 義 鏈 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3')由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；RNA小量抽提試劑盒與逆轉錄試劑盒（日本Takara）；Talent熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR 引物（PEDF：正 向5'-TTCAAAGTCCCCGTGAACAAG-3'，反 向5'-GAGAGCCCGGTGAATGATGG-3'；GAPDH：正向 5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，反 向 5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'）由上海生工生物工程有限公司合成；PEDF ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；PEDF-34由南京晨胎生物科技有限公司合成；眼球固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）。

1.2 細胞培養與照射

ARPE-19 細胞購自北京中生奧邦生物科技有限公司，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素與100 μg/mL 鏈霉素的DMEM：F12 培養基于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2～3 d傳代一次。細胞照射采用RS-2000 Pro 型X 射線輻照儀（美國Rad Source），管電壓為160 kV，管電流為25 mA、劑量率為1.1 Gy/min，劑量率采用指型電離室標定。

1.3 CCK-8細胞活力測定

取對數生長期的ARPE-19 細胞，以4 000 個細胞/孔接種于96 孔板中，待X 射線處理48 h 后每孔加入10 μL CCK-8溶液并孵育2 h，采用Synergy 2酶標儀（美國BioTek）測定450 nm的吸光度，以空白對照組的吸光度定為100%細胞活力。

1.4 siRNA轉染

取對數生長期的ARPE-19細胞，以20 000個細胞/孔接種于6 孔板中，過夜培養貼壁，采用Lipofectamine RNAiMAX Reagent 轉 染 siRNA（25 pmol/每孔），繼續培養2 d后進行后續實驗。

1.5 RNA提取與逆轉錄

細胞總RNA 采用RNA 小量抽提試劑盒提取，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應體系：5 倍的反應緩沖液2 μL（含dNTP、Mg2+）、逆轉錄酶混合物0.5 μL（含RNA 酶抑制劑）、Oligo dT 引物25 pmol、總RNA 500 ng、用純水補足體積到10 μL。反應條件：先37 ℃、15 min，后85 ℃、5 s。

1.6 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應體系：上述逆轉錄反應體系2 μL、2 倍的Talent qPCR PreMix 10 μL、正向引物6 pmol、反 向 引 物6 pmol、50 倍ROX 參 考 染 色0.4 μL、用純水補足體積到20 μL。采用ViiA7熒光定量PCR 儀（美國Life Technologies）進行擴增分析，反應條件：預變性95 ℃3 min、PCR 40個循環，每循環95 ℃5 s、60 ℃15 s。相對定量分析采用2-ΔΔCt法，以GAPDH 為內參對照，陰性對照siRNA 轉染組表達為1。

1.7 ELISA測定PEDF濃度

ARPE-19 細胞siRNA 轉染2 d 后換液，繼續培養4 h 取上層培養基，4 ℃1 000×g離心20 min，采用PEDF ELISA試劑盒進行濃度測定，PEDF標準品倍稀釋后與樣本分別加入ELISA微孔板，37 ℃孵育90 min，用洗滌液洗板2次，每孔加入生物素標記抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入辣根過氧化物酶-鏈霉親和素偶聯物工作液，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，加入顯色液，37 ℃孵育15 min，加入終止液后采用酶標儀測定450 nm的吸光度。將標準濃度與相應吸光度繪制標準曲線并計算樣本PEDF濃度。

1.8 PEDF蛋白結構可視化

PEDF 蛋白結構文件下載于Molecular Modeling Database（PDB ID：1IMV），采用PyMol 2.3.5軟件進行蛋白三維結構的可視化。

1.9 小鼠視網膜輻射損傷模型

6～8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，將PEDF-34溶于醫用生理鹽水，終濃度為2 nmol/L。小鼠隨機分為三組：空白對照組、20 Gy照射組和20 Gy照射與PEDF-34處理組。照射前使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，采用小動物放射治療模擬定位機X-RAD SmART（美國Precision）設左右兩野對穿照射小鼠眼部，圓形準直器直徑5 mm，管電壓225 kV，管電流13 mA，每野各照射10 Gy X 射線，采用儀器內置平板探測器進行劑量測定。照射結束后于SPF 動物房飼養，PEDF-34處理組每天在小鼠眼球滴加PEDF-34溶液2 μL，其余兩組滴加生理鹽水，滴加處理4周后繼續飼養，于照射8 周后取眼球固定，石蠟包埋切片，進行HE染色與TUNEL染色。本動物實驗經蘇州大學實驗動物倫理委員會批準。

1.10 統計學分析

使用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（Mean±SD）表示，樣本均數比較采用單因素方差分析，p<0.05 表示組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制PEDF 功能對APRE-19 細胞輻射損傷的作用

作為一種分泌型糖蛋白，PEDF 通過與相應的受體結合發揮生物學作用，PEDF 受體抑制劑ATG或BEL 可阻斷其受體的信號傳導，從而發揮抑制PEDF的功能［10-11］。圖1顯示4 Gy X射線輕微降低了ARPE-19 細胞的活力，但沒有統計學差異，預處理10 μmol/L ATG 或1 μmol/L BEL 2 h，再處理X 射線可顯著降低細胞活力，與各自單純藥物處理組相比有統計學差異，提示抑制PEDF 功能可以增強X 射線對ARPE-19細胞的損傷作用。

圖1 PEDF受體抑制劑聯合X射線處理對ARPE-19細胞活力的作用；*p<0.05，**p<0.01Fig.1 Effects of PEDF receptor inhibitors and X-ray on the cell viability of ARPE-19 cells;*p<0.05,**p<0.01

2.2 降低PEDF 表達對APRE-19 細胞輻射損傷的作用

為降低ARPE-19 細胞中PEDF 的表達，我們針對PEDF基因序列設計了三對siRNA，轉染2 d后提取細胞總RNA進行逆轉錄熒光定量PCR分析。圖2（a）顯示三對siRNA 均可降低PEDF 的mRNA 表達水平，其中siRNA-1 效果最佳，用于后續實驗。ELISA證實轉染siRNA-1能夠顯著降低細胞培養基中的PEDF 濃度（圖2（b）），說明ARPE-19 細胞分泌PEDF 受到了抑制。siRNA-1 轉染ARPE-19 細胞2 d后處理4 Gy X射線，結果表明，siRNA-1轉染組的細胞活力顯著低于陰性對照siRNA轉染組（圖2（c））。

圖2 降低PEDF表達對ARPE-19細胞輻射損傷的作用：(a)三對siRNA轉染對PEDF mRNA水平的作用；(b)ELISA檢測siRNA-1轉染后培養基中PEDF的濃度；(c)siRNA-1轉染聯合X射線對ARPE-19細胞活力的作用；*p<0.05，**p<0.01Fig.2 Effects of PEDF downregulation on the radiationinduced damage of ARPE-19 cells:(a)effects of three siRNA duplexes transfection on the PEDF mRNA levels;(b)PEDF concentration in the medium measured by ELISA after transfection of siRNA-1;(c)effects of siRNA-1 transfection and X-ray on the cell viability of ARPE-19 cells;*p<0.05,**p<0.01

2.3 PEDF-34對APRE-19細胞輻射損傷的作用

PEDF中保守的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結構域中包括10 個α 螺旋和3 個β 折疊，PEDF-34 是PEDF上從第44 位天冬氨酸（Aspartic acid，D）到第77 位的天冬氨酰（Asparagine，N）的含34 個氨基酸的多肽，覆蓋了1 個α 螺旋。圖3（a）用紅色顯示了其在PEDF 蛋白結構中的位置和氨基酸序列。PEDF-34可通過滴眼直接進入眼球后方，在視網膜處達到足夠的濃度，無需損傷性玻璃體注射，無需特殊溶劑載帶，具有神經保護和抗血管生成作用［12-13］。圖3（b）顯示10 pmol/L PEDF-34預處理2 h的細胞活力顯著高于單純照射組，說明PEDF-34預處理對X射線引起的ARPE-19細胞損傷具有一定的保護作用。

圖3 PEDF-34對ARPE-19細胞輻射損傷的保護作用：(a)PEDF的蛋白結構及PEDF-34的氨基酸序列；(b)PEDF-34預處理后X射線照射引起的ARPE-19細胞活力變化；*p<0.05(彩色見網絡版)Fig.3 Protective effects of PEDF-34 on ARPE-19 cells:(a)the protein structure of PEDF and the amino acid sequence of PEDF-34;(b)pretreatment of PEDF-34 altered the cell viability of ARPE-19 cells damaged by X-ray;*p<0.05(color online)

2.4 小鼠視網膜輻射損傷模型的構建與組織學觀察

為了研究PEDF-34 在體內對視網膜輻射損傷的作用，采用小動物放射治療模擬定位機對C57BL/6J 小鼠眼部設置左右照射野，分別照射10 Gy。圖4（a）顯示了兩個照射野在矢狀面、水平面、冠狀面CT圖像上的投影，可見兩眼均在照射野范圍內。照射后每天用含2 nmol/L PEDF-34的生理鹽水滴眼處理4 周，繼續飼養4 周后取眼球進行HE 染色；圖4（b）顯示20 Gy處理組的RPE細胞層增厚和結構異常與感光層的分界略有不清，內核層與外核層結構略有異常，而PEDF-34 處理組保持了正常的視網膜結構，提示PEDF-34對X射線誘導的視網膜損傷具有一定的保護作用。

圖4 PEDF-34滴眼處理對小鼠視網膜輻射損傷模型的作用：(a)左右照射野在矢狀面、水平面、冠狀面的投影；(b)小鼠視網膜HE染色Fig.4 Effects of PEDF-34 eye drops on radiation-induced retinal injury in mouse model:(a)median sagittal section,transverse section,and coronal section of the left and right irradiation fields;(b)HE staining of the mouse retina

2.5 PEDF-34處理對視網膜細胞凋亡的作用

TUNEL 染色顯示20 Gy 照射組的小鼠視網膜外核層中存在凋亡細胞，而在空白對照組與PEDF-34 處理組中未觀察到凋亡細胞（圖5）。外核層主要由感光細胞胞體組成的，說明20 Gy 照射可以誘導感光細胞發生凋亡，PEDF-34 處理可抑制感光細胞發生凋亡。

圖5 TUNEL染色檢測PEDF-34滴眼處理對小鼠視網膜細胞凋亡的作用Fig.5 Effects of PEDF-34 eye drops on retinal cell apoptosis detected by TUNEL staining

3 討論

在眼部和頭頸部腫瘤放射治療中，如眼球正常組織受到過量電離輻射照射，會誘導氧化應激損傷、炎癥反應、血管內皮損傷，從而導致視網膜細胞變性壞死、血供障礙，進而引發病理性血管生成，最終導致視覺障礙［14］。在視網膜中，PEDF主要由RPE細胞分泌，具有保護感光細胞、抗氧化、抗炎、抗血管生成作用，本研究在體內外實驗中初步研究了PEDF 對視網膜輻射損傷的保護作用，在ARPE-19細胞中發現處理PEDF 受體抑制劑或降低PEDF 表達可加重X射線誘導的細胞損傷，在小鼠模型中發現眼部局部處理含PEDF-34 的生理鹽水能緩解視網膜損傷，提示PEDF 及其多肽片段對于放射性視網膜病變具有一定的保護作用。

研究表明，PEDF 能維持RPE 細胞［6］、脈絡膜內皮細胞［15］、神經節細胞［16］、感光細胞［17］等多種視網膜細胞的正常功能，外源性給予PEDF 可防治糖尿病視網膜病變［3］、光誘導的視網膜損傷［18］。本研究發現，PEDF 的功能缺失使體外培養的RPE 細胞更易受到輻射損傷，而給予PEDF-34 可提高輻射抵抗性。RPE 細胞具有吞噬光感受器外段、促進視網膜代謝、保持離子與電生理穩態的功能，對于保持視網膜正常功能和血-視網膜屏障完整性具有重要意義。在小鼠模型中，20 Gy X射線照射8周后，RPE細胞層出現了結構異常，可能使視網膜支持能力受損、血-視網膜屏障破壞，是電離輻射誘導小鼠視網膜損傷的病理基礎。PEDF-34 滴眼是無損的眼部藥物輸送方法，可以使眼球后部達到有效的濃度［13］，組織學觀察發現，PEDF-34 滴眼可以減輕RPE 細胞層的病理改變，并減少視網膜感光細胞的凋亡。

目前對于PEDF保護RPE細胞對抗電離輻射的分子機制尚不明確，有研究證實，PEDF具有抗凋亡功能，可降低視網膜細胞損傷時多種凋亡相關基因的表達與活化［6］。在過氧化氫誘導的氧化應激中，PEDF 可 激 活ERK1/2 與PI3K/Akt 通 路、抑 制p38/MAPK 信號、維持線粒體功能，從而降低活性氧對細胞的損傷［19］。此外，PEDF還可抑制視網膜病變過程中腫瘤壞死因子α、轉化生長因子β與單核細胞趨化蛋白等炎癥因子的表達，減輕炎癥反應［20］。PEDF與其多肽片段的視網膜輻射損傷保護能力可能與其抗凋亡、抗氧化、抗炎的功能有關。有研究表明，氧化應激損傷引起RPE細胞的死亡方式較為復雜，壞死與鐵死亡可能都參與了RPE 細胞的損傷過程［21-22］，這兩種死亡方式是否參與PEDF對RPE細胞的防護作用需要進一步的研究明確。

4 結論

PEDF 受體抑制劑處理或降低PEDF 表達可增強X 射線對APRE-19 細胞的損傷作用，給予PEDF-34 多肽片段對X 射線引起的ARPE-19 細胞損傷具有保護作用。小鼠實驗表明，20 Gy X射線照射后視網膜色素上皮細胞層出現結構異常，外核層含有凋亡細胞，PEDF-34 多肽片段滴眼處理組能夠保持視網膜的正常結構且無凋亡細胞。本實驗結果揭示了PEDF 對X 射線誘導RPE 細胞損傷的保護作用，證實了PEDF-34 多肽片段對視網膜X 射線損傷有一定的防治功能，為研發治療放射性視網膜病變的方法提供了新的思路。PEDF 其他活性多肽片段是否也具有同樣的效果及其內在分子機制仍需進一步的驗證與研究。

作者貢獻說明 朱冉是本研究工作的主要執行者，負責體外細胞實驗與小鼠模型實驗，并完成論文初稿寫作；丁伯洋協助體外細胞實驗，負責細胞活力的測定；李文艷負責蛋白與多肽的結構分析；李婕負責組織學實驗；劉芬菊參與實驗設計與論文撰寫；陳新建指導小鼠視網膜損傷模型的構建與鑒定；俞家華負責實驗設計，結果分析，論文撰寫與修改。全體作者均已閱讀并同意最終的文本。