黃連素對PCOS模型大鼠LPS /NF-κB、MAPK信號通路的影響*

趙粉琴， 趙 艷， 劉潔穎， 茍雅姣， 楊永琴

(甘肅中醫藥大學中西醫結合學院， 蘭州 730000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)以月經紊亂、不孕、高雄激素，或(和)肥胖[1]，50%～70%胰島素抵抗(IR)[2]，慢性炎性狀態[3]為特征的女性內分泌疾病。早期以生殖紊亂為主，后期則以糖脂代謝紊亂[2]和血栓栓塞以及動脈粥樣硬化疾病[4]高發為主。胰島素抵抗是PCOS 代謝異常程度的重要決定因素[2]，研究其發病機制以尋求長期管理的方法以及中藥治療成為目前研究關注點。

絲裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 家族是介導細胞反應的重要信號通路，其中p38-MAPK和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun nterminal kinase，JNK)是主要兩個亞型，可以被炎性因子、游離脂肪酸、高糖和氧化應激等炎癥細胞因子激活并參與調節胰腺β細胞的胰島素分泌，引起的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和慢性炎性變化[5]，參與調控PCOS的發病[6]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性細菌外膜的組成成分，通過激活p38-MAPK和c-Jun 末端激酶(JNK)途徑激活核因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)，與慢性低度炎性綜合征，如糖尿病、肥胖、PCOS 等疾病的關系密切[7]。

達英-35是治療PCOS經典藥物，雌孕激素聯合應用調整月經周期，同時通過抑制PCOS卵泡膜細胞合成雄激素，有降低血清雄激素作用。但在青春期使用存在促進肥胖和胰島素抵抗，育齡期應用調整月經周期保護子宮內膜作用，但是用藥起效慢(3～6個月)，尤其是存在導致血栓高發風險，限制其在臨床長期應用。二甲雙胍是胰島素增敏劑，通過改善脂代謝紊亂的作用維持胰島素的功能和形態[8]，可以糾正PCOS導致的IR有關的某些代謝性紊亂綜合征[9]，但對雄激素水平沒有改善作用。尋求一種長期管理PCOS的安全用藥成為關注的焦點。

研究表明黃連素可有效抑制LPS誘導NF-κB信號通路中關鍵通路蛋白的表達，并能抑制細胞的MAPK信號通路中p38-MAPK和c-Jun蛋白的表達而用于治療腸道炎癥[10]，也可以改善IR[11-13]。但是對于黃連素單獨用于治療PCOS作用機制研究較少。本研究從核轉錄因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路入手探索黃連素是否通過影響卵巢組織p38-MAPK/c-Jun/NF-κB信號通路蛋白的表達，達到協調PCOS血清性激素分泌以及改善糖脂代謝異常的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級SD大鼠6周齡50只(200±20)g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2015-0005。室溫20～25℃，常規飼料喂養，3 d后用于實驗研究。

1.2 藥品和試劑

來曲唑(每片2.5 mg，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，H19991001)，黃連素(每片0.1 g)，北京中新制藥廠，H11020962)，鹽酸二甲雙胍片(每片0.5 g，中美上海施貴寶制藥有限公司，H20023370)，達英-35(炔雌醇環丙孕酮片，每片含2 mg醋酸環丙孕酮和 0.035 mg炔雌醇，拜耳醫藥保健有限公司，J20140114)，羧甲基纖維素鈉(CMC)(國藥集團化學試劑有限公司，國藥準字H20181203)，血脂和胰島素試劑盒購自江蘇麥莎，總膽固醇(TC，MS3486-B)，甘油三酯(TG，MS3485-B)，胰島素(INS，MS3462-B)，性激素和炎性因子試劑酶聯免疫試劑盒購自江蘇菲亞生物科技有限公司(促黃體生成素(LH，MM-0624R1)，促卵泡生成素(FSH，MM-0566R1)，雌二醇(E2，MM-0575R1)，睪酮(T，MM-0624R2)，孕酮(P，MM-0551R1)性激素結合球蛋白(SHBG，MM-0483R2)，脂多糖(LPS，MM-0647R2))；PVDF膜(廠家：Millipore公司，批號：IRVH00010)；ECL發光液(廠家：MILIIPORE，批號：P36599)，Glycine(批號：G8200)、Tris(批號：T8060)、SDS(批號：S8010)，RIPA裂解液(批號：R0010)，Tween-20(批號：20150702)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號：P1200)，BCA蛋白定量試劑盒(批號：PC0020)，p38 MAPK抗體 [N1C3-2]、NFkB p65抗體和c-Jun抗體(廠家：GeneTex，批號：GTX110720、GTX107678和 GTX11914)。

1.3 實驗分組、造模以及藥物干預

隨機分出10只為空白組，其余進行造模。動物造模方法：用來曲唑1 mg/(kg·d)，連續灌胃3 周，以陰道脫落細胞顯示動物處于動情間期為造模成功；然后隨機分成四組，每組10只，分別是模型組、達英組、二甲雙胍組和黃連素組。達英-35組給藥劑量(0.18 mg/(kg·d)(70 kg人的劑量按照醋酸環丙孕酮2 mg/d))，二甲雙胍組給藥劑量(0.135 g/(kg·d)(70 kg人的劑量1.5 g/d))；黃連素組給藥劑量(0.216 g/(kg·d)(換算成大鼠劑量0.108 g/(kg·d)(70 kg人的劑量1.2 g/d))相當于人的劑量的2倍)結合參考文獻[14]，為最佳劑量；每只大鼠灌胃2 ml，空白組和模型組用生理鹽水灌胃，連續用藥28 d。

1.4 大鼠體重、卵巢指數、子宮指數檢測

給藥結束后禁食12 h，稱重，頸椎脫位處死動物，取子宮、卵巢，精密稱得各臟器的質量，一側卵巢組織，4% 多聚甲醛溶液固定做HE 染色，一側卵巢用液氮凍存。并計算單側卵巢指數(單側卵巢重量mg/大鼠體重g)，子宮指數(子宮重量mg/大鼠體重g)。

1.5 經蘇木精-伊紅(HE) 染色于光鏡下觀察卵巢組織病理變化

取多聚甲醛溶液固定的卵巢組織，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后， 以4 μm厚連續切片，HE染色(BDH，普爾，英國)。光鏡下觀察卵巢變化，每個卵巢以5張切片為宜，計算所有切片卵泡數量和級別。

1.6 大鼠血清性激素、糖脂代謝水平的檢測

給藥結束后禁食12 h，尾尖取血采用(欣舒測AB-103G血糖儀，批號：CZ119799)(葡萄糖脫氫酶法)測空腹血糖(fasting plasma glucose，FBG)值。在處死前心臟取血1.5 ml，在4℃以3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清移入EP管，置于-20℃冰箱保存，做其他血清學指標檢測。采用酶法測空腹胰島素(insulin)、甘油三酯(triglyceride，TG)和膽固醇(cholesterol，TC)；采用ELISA法檢測血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌激素(estrogen，E2)、睪酮(testosterone，T)和孕酮(progesterone，P)；性激素結合蛋白(sex hormone binding protein，SHBG)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，按試劑盒操作步驟進行，96孔檢測，設置空白孔(不加樣)，標準孔(加樣50 μl)，待測孔(先加樣品稀釋液40 μl，再加待測樣10 μl)，顯色，在15 min內使用酶標儀在450 nm波長進行吸光度 (OD) 檢測。計算穩態模型胰島素抵抗指數(homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)。HOMA-IR 公式為：HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/ 22.5。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測卵巢組織p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達

取凍存卵巢組織200 mg，按照試劑盒說明進行，加入一抗(p38-MAPK和NF-κB為1∶1 000 稀釋，c-Jun為1∶250 稀釋)，以β-actin(1∶5 000)抗體為內參，4℃孵育過夜。洗膜后加二抗，山羊抗兔(1∶5 000稀釋) 孵育2 h，免疫熒光增強法顯色，采用Image J對條帶進行灰度值分析量化。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠體重、卵巢指數、子宮指數比較

與空白組比較，模型組大鼠體重明顯增加(P<0.05，表1)，子宮指數降低(P<0.05)，卵巢指數無影響；與模型組比較，二甲雙胍組、達英-35組、黃連素組能增加子宮指數(P<0.05)，對卵巢指數無影響。

Tab. 1 The body weight, ovarian index and uterine index in each group n=10)

2.2 大鼠卵巢組織病理學

空白組卵巢內有不同發育階段的卵泡及多個黃體，成熟卵泡顆粒細胞多為6～8 層，形態完整，排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列。模型組卵泡囊性擴張，多個初級卵泡，竇卵泡顆粒細胞層變薄，個別呈空泡樣變性。與模型組比較，黃連素增加初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數量(P<0.05，圖1，表2)，與達英-35類似，尤其可以降低閉鎖卵泡數量(P< 0.05)和囊狀卵泡數量(P<0.01)，而二甲雙胍在增加成熟卵泡和降低囊狀卵泡方面有差異(P<0.05)。

Tab. 2 The number of follicles of different grades in each group n=10)

Fig. 1 Histopathologicalprofiles of ovary tissues(HE ×400) multiple follicles (black arrows), vacuolated degeneration (red arrow), sinus follicles, absence of oocyte nuclei (white arrows);A,A1: Control group; B,B1: Model group; C,C1: Dyne-35 group; D,D1: Metformin group; E,E1： Berberine group

2.3 大鼠血清性激素水平變化

與空白組比較，模型組大鼠血清LH、T水平和LH/FSH比值升高(P<0.05，表3)，FSH水平下降(P<0.05)，E2和P水平無差異，符合PCOS血清學標志；與模型組比較，黃連素降低大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值(P<0.05)，作用與達英-35、二甲雙胍類似，尤其在降血清T水平作用更顯著(P<0.01)，對血清E2和P影響差異無統計學意義。

Tab. 3 The levels of FSH, LH, E2, T and P in rats n=10)

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsmodel group

2.4 大鼠血清糖脂代謝變化

與空白組比較，模型組大鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、胰島素含量和胰島素指數(HOMA)增加(P<0.05，表4)，空腹血糖(FBG)變化沒有差異(P>0.05)；與模型組比較，黃連素組能降低甘油三酯(TG)、空腹胰島素水平和胰島素指數(P<0.05)，作用類似二甲雙胍組，而達英-35對PCOS大鼠糖脂代謝沒有影響(P>0.05)。

Tab. 4 The levels of TG， TC， FBG， Insulin and HOMA in rats n=10)

2.5 大鼠血清性激素結合蛋白和脂聯素含量分析

與空白組比較，模型組大鼠血清SHBG減少，LPS含量增加(P<0.05，表5)；與模型組比較，黃連素能增加血清SHBG和降低LPS含量(P<0.05)，作用與二甲雙胍類似，而達英-35可以增加血清SHBG含量(P<0.05)。

Tab. 5 The levels of SHBG and LPS in rats n=10)

2.6 大鼠卵巢組織炎性蛋白表達分析

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織內p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達增加(P<0.05，圖2，表6)；與模型組比較，黃連素能明顯下調大鼠卵巢內p38-MAPK和NF-κB蛋白表達(P<0.05)，對c-Jun蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，作用與達英-35類似，而二甲雙胍對卵巢內38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達差異無統計學意義(P> 0.05)。

Tab. 6 The expression levels of p38-MAPK, c-Jun and n=10)

Fig. 2 Protein expressions in rat ovary tissues

3 討論

多囊卵巢綜合征(PCOS)的月經紊亂和不孕嚴重影響女性的生殖和健康。肥胖、性激素代謝和糖脂代謝紊亂以及胰島素抵抗(IR)是 PCOS 發生發展的重要危險因素。PCOS患者胰島素抵抗，與高水平黃體生成素(LH)和雄激素(T)水平增加互為因果，已經成為PCOS診斷不可或缺的臨床和血清學指標[2]。改善導致PCOS 代謝異常程度的重要決定因素-胰島素抵抗(IR)，是治療PCOS的重要方法之一?，F在研究表明PCOS 的病理機制不再單純地局限于下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調，可能與腸道菌群紊亂[15]產生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活 TLR4/NF-κB 信號通路，啟動炎癥因子活動導致肥胖和胰島素抵抗(IR)發生[16,7]。所以研究PCOS導致IR發病機制以及對其干預作用就顯得尤為重要。

血液中雄激素濃度較高和/或臨床表現高雄激素狀態是多囊卵巢綜合征(PCOS)發病的關鍵[2]，雄激素(T)分泌量過多，抑制卵泡發育成熟以及合成雌二醇障礙，反饋性刺激垂體分泌LH量增加，進一步抑制卵泡發育成熟，卵巢呈多囊樣改變。研究表明黃連素降低PCOS大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值，增加卵巢內初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數量，作用與達英-35類似，尤其可以降低閉鎖卵泡數量和囊狀卵泡數量，這與黃連素抑制PCOS卵巢組織p38和JNK蛋白表達，p38/JNK顯著降低卵巢內細胞色素P450 17α-羥化酶(CYP17)m RNA 的表達，促進卵巢顆粒細胞的自噬，抑制卵泡膜細胞合成雄激素的能力，改善 PCOS高雄激素狀態有關[17]。同時也與黃連素減低LPS水平，抑制NF-κB活性，減輕卵巢組織炎性狀態，促進多囊卵巢患者顆粒細胞類固醇的生成[18]有關。此結果與Xie研究[19]黃連素在降低PCOS患者總睪酮和黃體生成素方面優于卵泡刺激素一致。同時黃連素也能明顯減低PCOS大鼠體重，減少總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量，與黃連素通過肝細胞發揮消耗葡萄糖，促進脂肪轉化，類似二甲雙胍，屬于胰島素增敏劑范疇[20,21]。同時達英-35、二甲雙胍和黃連素都有升高血清SHBG，這與他們降低血清睪酮、減輕體重和減輕胰島素抵抗，促進雌激素分泌，促進肝臟合成性激素結合蛋白能力有關[2]。

綜合以上研究，黃連素除了與二甲雙胍都可以改善PCOS大鼠糖脂代謝異常和減輕體重，同時也可以降低PCOS大鼠高雄激素和高黃體生成素水平，作用類似達英-35，其作用機制可能是改善PCOS慢性炎性狀態，抑制卵巢內p38-MAPK、c-Jun和NF-κB蛋白表達促進顆粒細胞自噬而實現，這可能是黃連素用于長期對PCOS管理的作用機制的一個方面，更多作用機制希望在以后研究中進行探討。