皮膚致敏性替代試驗方法的研究進展

黃靜怡, 李培寧, 劉香梅, 劉忠華, 黃宇鋒

(1. 華南農業大學獸醫學院,廣州 510630; 2. 廣州質量監督檢測研究院,廣州 511447)

過敏性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD） 是由低分子量化合物（low molecular weight，LMW）與存在于皮膚中的內源蛋白結合形成的Ⅳ型超敏反應。ACD 的臨床癥狀通常表現為皮膚瘙癢、紅斑及丘疹等。LMW普遍存在于化學品、藥品以及個人護理用品中，LMW與皮膚的頻繁接觸會導致ACD發病率增加。研究表明，在歐洲特定人群中，ACD 的患病率高達18.6%，占西方世界工作人口中所有職業性皮膚病的85%～90%［1］。因此，ACD 已經成為一種職業性皮膚病，在一定程度上影響了人類的正常生活和工作。

傳統的皮膚致敏性測試通常采用的是動物實驗，譬如豚鼠最大值試驗（guinea pig maximization test，GPMT）、Buehler 封 閉 斑 貼 試 驗（Buehler test，BT）等。然而，隨著近年來毒理檢測技術的進步、研究方法的更新、動物倫理被越來越多的國家重視和關注，皮膚致敏性測試替代方法的開發就顯得尤為重要。因此，本文結合國內外研究進展，就體內替代致敏方法、基于有害結局通路（adverse outcome pathway，AOP）機制的體外替代方法以及基因組過敏原快速檢測法（genomic allergen rapid detection，GARD）等目前幾類皮膚致敏性測試替代方法進行綜述。

1 體內替代方法

皮膚致敏體內替代方法是指使用小鼠替代豚鼠作為實驗動物主體，建立小鼠局部淋巴結測試法（local lymph note assay，LLNA）。根據LLNA 法的優點和局限性，研究人員開發了基于LLNA 法的改良方法，即5-溴 脫 氧 尿 嘧 啶 核 苷 （5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）-酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）-LLNA 法和LLNA-內源性三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測法。

1.1 基礎的LLNA法

LLNA是鑒別化學物質是否具有致敏潛力的替代測試方法之一，已被歐盟67/548/EEC 指令認可。LLNA是以致敏物能誘導皮膚接觸部位引流淋巴結中的T 細胞活化增殖為基礎，將被放射性物質標記的核酸（如3H-甲基胸腺嘧啶脫氧核苷、125I-碘脫氧尿嘧啶核苷等）由尾靜脈注入小鼠體內［2］，5 h后取誘導部位淋巴結制備單細胞懸液，測定T細胞增殖情況。

該方法的檢測指標有兩個。一是刺激指數（stimulation index，SI），即受試組與對照組增殖T細胞的比值，該指標用于判斷受試物是否為致敏劑。當SI≥3 時，受試物被判定為致敏劑［3］。另一個檢測指標是SI=3時的有效化學品濃度（effective chemical 3，EC3），該值可以通過劑量-反應數據的線性差值得出［4］，用于受試物的致敏能力分級。根據歐洲化學品生態毒理學和毒理學中心公布的數據，當EC3＜0.1%時，受試物判定為極強致敏劑；當EC3在0.1%～1%時，受試物為強致敏劑；EC3在1%～10%時，受試物為中度致敏劑；EC≥10%，則為弱致敏劑［5］。

LLNA法具有周期短、實驗動物使用量少、判定方法更為客觀準確等優點，同時不需用弗氏佐劑來刺激受 試 動 物， 符 合 3R （reduction、 repIacement、refinement）原則。LLNA 法已于2010 年被世界經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）納入皮膚致敏檢測方法指南［6］。值得一提的是，LLNA 法易被受試物的溶解性所限制。因水溶性大分子物質很難在小鼠的皮膚上涂抹均勻并被吸收［7］，因此該方法只適用于脂溶性的小分子物質。

1.2 已通過驗證的LLNA改良法

1.2.1 BrdU-ELISA-LLNA法

2003 年，Takeyoshi 等［8］利用示蹤劑代替放射性標志物建立了LLNA 的改良方法，即BrdU-ELISALLNA（又稱LLNA：BrdU-ELISA）。其在原理和檢測指標方面，與LLNA 法基本一致，但在核酸標志物方面改用與胸腺嘧啶結構相似的BrdU。即在末次染毒24 h 后腹腔注射BrdU，處死小鼠取淋巴結，稱重后制備細胞懸液，然后采用ELISA 法檢測增殖細胞中BrdU的標記數。

該方法綜合了LLNA 試驗周期短、動物用量少、判定方法客觀的優點，還解決了LLNA 法使用放射性標記物的安全性問題。在OECD 指南中，該方法推薦使用CBA 小鼠，但這種品系的小鼠在我國供應數量較少，且價格偏貴。因此，有學者通過對比分析BALB/c和CBA 兩種品系小鼠用該方法試驗的結果，證實可以使用BALB/c 小鼠替代CBA 小鼠進行LLNA：BrdUELISA法檢測［9］。除此之外，該法腹腔注射BrdU時會使小鼠痛苦，不符合動物福利?；诖?，有研究團隊改進了LLNA：BrdU-ELISA 法，先給小鼠耳部染毒后處死，取耳后引流淋巴結，在含有BrdU的培養基中體外培養淋巴細胞24 h后，再對淋巴細胞中的BrdU含量進行測定［10］。

1.2.2 LLNA-ATP檢測法

LLNA-ATP 檢測法（又稱LLNA：DA） 是基于ATP水平與活細胞數呈正相關，并且可與熒光素-熒光素酶復合物作用產生可測定光這一原理，因此可以通過生物熒光法檢測細胞中ATP 的含量來確定受試物的致敏性［11］。該法選用的測試指標包括ATP發光值、淋巴結質量、增殖的淋巴細胞數，以及SI和EC值［12］。

該方法具有LLNA：BrdU-ELISA 法的全部優點，但因將ATP 數量作為測試指標，有著明顯的局限性。（1）時間限制：動物死后體內ATP 數量會逐漸下降，若長時間不進行測定，測試結果會出現偏差。因此，OECD 指南明確規定待測樣本從取材到檢測的時間應在20 min以內［13］。（2）假陽性：為解決這個問題，有研究人員提出，可以同時開展耳重、耳厚差等活組織檢測以及紅斑評級，以排除受試物的刺激性對結果的影響［14］。（3）該法不適用于影響ATP生成和穩定性的受試物，例如ATP抑制劑等［14］。

2 基于AOP的體外替代方法

2007 年，由美國國家科學研究委員會首次提出AOP，用以描述皮膚敏化從分子起始事件到系統敏化效應產生過程中的一系列反應事件。2012 年，OECD提出將皮膚變態反應的體外研究方法整合，建立基于AOP原理的皮膚致敏預測方法［15-16］，包括直接反應肽試驗（direct peptide reactivity assay，DPRA）、氨基酸衍生物反應性測定（amino acid derivative reactivity assay，ADRA）、KeratinoSensTM/LuSens試驗和人細胞系活化試驗（human cell line activation test，h-CLAT）。

皮膚致敏AOP 機制由4 個要素組成：（1）起始事件（molecular initiating event，MIE）是抗原和皮膚蛋白結合形成免疫復合物半抗原；（2）角質細胞反應是半抗原被角質細胞攝取，發生炎性反應，產生的炎性因子激活樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）；（3）DCs反應是DCs 被激活后攝取呈遞抗原，表面特異性標志物表達上升，釋放的細胞因子激活T 細胞；（4）組織/器官層次事件是DCs 提呈相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）后遷移至淋巴結，T細胞識別MHC 形成特異性T 細胞，當機體再次接觸同種抗原時發生ACD。與毒性反應不同，AOP 最關鍵的特征是以可檢測到的4 種分子事件的定向關系為研究要點［17］。

2.1 DPRA化學法

Gerberick 團隊于2004 年開發了DPRA 法，該方法模擬致敏物質與皮膚蛋白共價結合形成半抗原（即AOP 通路中起始事件）的過程。采用化學方法將致敏原與谷胱甘肽以及半胱氨酸和賴氨酸多肽的肽模板反應結合，再使用高效液相色譜-紫外線檢測（high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV）測定兩種結合抗原的消耗情況，以此來判定受試物致敏能力［18］。其檢測結果與LLNA法的一致性可達到89%。該方法已于2015年被OECD收錄至TG 442C指南［19］。

目前該法主要用于單一化學品或化妝品原料的致敏測定，未能應用到化妝品成品檢測。2009 年，Gerberick等［20］對DPRA法進行了改良，在反應體系中加入了辣根過氧化物酶-過氧化氫，使該方法擁有檢測抗原前體物的能力，擴大了檢測范圍，為拓展DPRA法的應用范圍打下了強有力的基礎。

為了提高檢測通量、靈敏度及準確性，Wei等［21］開發了一種基于384 孔板的快速固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）-串聯質譜（tandem mass spectrometry，MS）-DPRA自動化快速檢測法。與HPLC-UV法相比，SPE-MS通量從每份樣品的16 min縮短到10 s，底物使用量也從100 mmol/L 減少到5 μmol/L，大大提高了檢測效率。

2.2 ADRA法

化學方法代替動物實驗進行皮膚致敏測試的局限性在于，HPLC-UV分析中待測化學品與親核試劑的共同洗脫，導致無法準確量化未反應的親核試劑以及預測待測物的致敏能力［22］。為解決這個問題，Fujita等［23］開發并驗證了一種新型的皮膚致敏替代方法，即ADRA法。

該方法的原理與DPRA 法類似，同樣模擬AOP 通路中的起始事件，只是在使用HPLC-UV 定量時改為281 nm 進行，提高了基線穩定性。該方法中使用的親核試劑是由Fujita團隊制定合成的兩種氨基酸衍生物乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和乙酰賴氨酸（N-α-acetyl-L-lysine，NAL）［24］。ADRA 法測試終點為NAC/NAL 的反應性，即根據待測物中未反應的NAC/NAL 濃度相對于對照組平均濃度下降值而計算出的消耗百分比。

2019年，Fujita團隊通過改用熒光檢測開發了新的ADRA-熒光檢測法（ADRA-fluorescence detection，ADRA-FL）［25］。相對于傳統ADRA 法使用HPLC-UV和高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence， HPLC-FL）， ADRA-FL

測量NAC和NAL時擁有更高的靈敏度和信噪比（指電子設備或者電子系統中信號與噪聲的比例）。研究人員對化妝品常用植物提取物溶液（蘆薈、甘草、綠茶）分析的結果顯示，該方法存在預測多成分物質致敏風險的可能性，但因受試物中含有免疫抑制劑，故無法評估免疫抑制效應。

2.3 KeratinoSensTM/LuSens試驗

半抗原由抗原和皮膚蛋白結合生成，當其接觸表皮角質形成細胞后，可引起氧化應激反應（即關鍵事件2）。在機體發生氧化應激時，抗氧化應激感受器的主要調控因子Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）與核轉錄因子E2 相關 因 子2 （nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）相互作用，對改善氧化應激至關重要［26］。

基于上述原理，研究人員開發了兩種來源于角質細胞水平的測試方法KeratinoSensTM和LuSens試驗。這兩種檢測方法的區別在于抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）不同：KeratinoSensTM試驗的ARE 來源于人的AKR1C2（Aldo-keto reductase family 1 member C2）基因，而后者來自大鼠的NQO1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1）基因［27］。兩種基因均含熒光素酶，因此都以熒光素酶的誘導倍數（fold of induction，FI）作為評價指標［27］，當FI＞1.5時可判斷受試物為致敏物。

有研究表明，與人類皮膚致敏數據以及LLNA 測試結果相比，KeratinoSensTM試驗的準確率分別為94%和93%，而LuSens 試驗稍低，分別為83%和74%［28］。目前，KeratinoSensTM試驗已被納入OECD 指南442D中［28］，而LuSens試驗還處于驗證階段。

2.4 h-CLAT法

h-CLAT 法的開發基于AOP 通路的關鍵事件3 和4（即DCs事件和組織/器官層次事件）。將急性單核細胞白血病THP-1細胞暴露于無細胞毒性的受試物中24 h，終止暴露后收集細胞，利用流式細胞儀測定細胞表面表達物CD86和CD54的相對熒光強度變化［29］，以此為依據判定待測物是否具有致敏性。

該測試方法需要重復3次試驗，且保證2次試驗結果均為有效，才能進行下一步判定。將結果與陰性對照組進行比對，如CD86＞150%且CD54＞200%，則表明THP-1 細胞被活化，判定受試物為致敏劑。研究表明，h-CLAT 法與LLNA 法的試驗結果一致性為84%［30］。2018 年，該方法被OECD 納入毒理學測試指南［31］。

治療前兩組患者的SAS、SDS評分對比差異并不顯著,P>0.05;治療前后比較兩組差異顯著,P<0.05;組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2:

袁園等［32］通過對h-CLAT 法驗證的10 種物質分別采用CCK-8細胞增殖/毒性檢測法和流式細胞儀法進行檢測，結果顯示兩種方法的組內相關系數為0.993，一致性很高。此外，研究人員還發現將IL-8 與CD86結合作為檢測終點也能夠對致敏物進行判定［33］。同時，該方法也可以用于篩選致敏生物標志物。Karkhanis 團隊于2021 年利用強致敏劑1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB）、中等強度致敏劑二氯化鎳（NiCl2）以及陰性對照二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理TPH-1 細胞，通過RNA 測序確定了5 種新型的h-CLAT 標志物：CD109、CD181、CD183、CLEC5A和CD354［34］。

3 基于基因組學的過敏原快速檢測法

隨著基因組學技術的發展以及對皮膚變態反應發生機制的研究不斷深入，研究人員將目光投向了基因組學方面。2011 年，Johansson 等［35］發現了一種細胞系——人類急性髓細胞白血病細胞系MUTZ-3，其在轉錄和誘導特異性T細胞產生應答等方面與DCs相似。MUTZ-3 分化后其免疫相關表型類似于未成熟的DCs，表達CD1d、MHCⅠ和MHCⅡ呈遞抗原，并誘導特異性T細胞增殖。

變態反應產生的生物標志物能夠對致敏物和非致敏物進行識別，并出現不同轉錄結果。因此，這些不同致敏劑的有效預測指標統稱為GARD 預測信號（GARD predictive signals，GPS）。GPS包括與先天免疫反應信號、DCs 成熟、應激反應和外來物質識別相關的基因，有著完整的能夠識別和監測皮膚致敏中各種關鍵事件的能力?；谶@一原理，研究人員建立了一種基于MUTZ-3 細胞的GARD 法。該方法的判斷終點是根據GPS 的轉錄水平，使用支持向量機（support vector machine，SVM） 賦予待測樣本一個決定值（decision value，DC）。DC＞0，為致敏劑；DC≤0，則為非致敏劑［36］。

GARD 是一種基于基因組讀數、新型且靈活的體外致敏評估法，該方法可測試200 個與致敏相關的基因轉錄組的變化。這些基因的生物標志物特征包括參與氧化應激、DCs 成熟以及細胞因子反應的轉錄本［37］。體內完整基因組所帶來的巨大的多功能性，為進一步發展和拓寬皮膚致敏分析方法提供了條件，也為進一步了解體內致敏的過程提供了參考。其次，整體基因組讀數提供的大量信息，還可用于特定信號或代謝途徑機制的研究［38］。此外，GARD法還可用于判定呼吸致敏劑，如Masinja 等［39］發現了一種能夠區分呼吸致敏劑和非致敏劑的生物標志物，并整理在尚未公開的數據庫中。

4 皮膚致敏替代方法的比較分析

隨著毒理學技術不斷發展以及人類對動物實驗越來越重視，研究人員逐步將目光投向皮膚致敏試驗替代方法的開發驗證。因而，越來越多的替代方法如LLNA、LLNA：BrdU-ELISA、DPRA、GARD等相繼出現，并通過驗證。

如表1 所示，各種替代方法均有不同的優缺點。這些方法的優勢大多集中于實驗動物的使用量減少，甚至是使用細胞替代了實驗動物，靈敏度和準確度較高，以及測試時間縮短等方面。但各個方法的局限性也很突出，尤其是結果假陽性以及對待測物的性質和溶解度要求較高等問題。皮膚致敏AOP 是一個完整的生物過程，而現有的替代方法無法完全覆蓋整個通路，因此有必要通過組合方法來改善。

表1 皮膚致敏替代方法的比較Table 1 Comparison of alternative methods of skin sensitization

5 整合策略與評估方法

皮膚變態反應是一個極為復雜的過程，憑借單獨的體外測試方法無法完整獲取皮膚致敏信息，若對皮膚致敏反應進行更進一步的探索，則需結合各種替代方法的靈敏度、優缺點等方面建立方法組合策略。因此，OECD 于2016 年發布了整合策略與評估方法來評價未知化合物的致敏性及其致敏效力。整合策略與評估方法是一種基于科學、實用的化學危害特征描述方法，即依據現有的化學結構特征信息、毒理學信息、計算機模型、體外實驗結果進行的綜合分析及整合測試策略，以評價受試物的致敏性和風險類別［54］。

定量構效關系（quantitative structure activity relationship，QSAR）是通過分析現有的某一系列具有相同生物活性且結構相似的化合物，以其理化或結構參數為自變量，生物活性為因變量，利用數理統計方法，建立化合物結構與其生物活性之間的定量關系［58］。QSAR 系統能夠對多個毒理學終點進行預測。近年來，研究人員嘗試將其應用到化妝品皮膚致敏性評價中，開發了類似的皮膚滲透性QSAR 模型，并闡明了化合物的皮膚滲透性與致敏性之間的關系［59］。同時，采用計算機模擬QSAR 軟件進行化妝品毒理學評價，也得到了越來越多的重視，例如化合物毒性預測工具樹（toxic hazard estimation，Toxtree）、OECD 開發的QSAR 工具箱（OECD QSAR Toolbox）、組織新陳代謝 模 擬 器（tissue metabolism simulator，TIMES-SS）等［60］。但這類軟件是作為單一致敏評估方法來開發和驗證的，因此一些國外大型日化企業將基于AOP 通路的皮膚致敏替代方法與這些QSAR 軟件結合后自主開發出皮膚致敏測試整合策略。

目前，OECD 在整合策略與評估方法指導文件中納入的整合策略大都由國外大型日化企業開發，例如德國巴斯夫（BASF） 公司開發的“3 選2”原則（BASF‘2 out of 3’）、美國寶潔（P&G）公司開發的貝葉斯網絡整合測試策略（Bayesian network integrated testing strategy）、法國歐萊雅（L’ORéAL）公司開發的堆疊元模型（Stacking Meta-mode），以及日本資生堂（Shiseido） 公司開發的人工神經網絡分析法（artificial neural network）等［61］。

5.1 “3選2”原則

該方法由德國巴斯夫公司開發，綜合了DPRA、KeratinoSensTM/LuSens 和h-CLAT 這3 種單一替代試驗方法［62］，該方法覆蓋了AOP中至少兩個關鍵事件。其判定方式為：若3種試驗中有2種結果呈陽性，則判定受試物為致敏劑，反之則為非致敏劑。與單一試驗相比，該整合策略預測結果的準確率為81%～88%。

5.2 貝葉斯網絡整合測試策略

該方法由美國寶潔公司開發，在涵蓋了DPRA、KeratinoSensTM和h-CLAT 這3 種單一替代方法的基礎上，增加了TIMES-SS基于受試物結構的預測以及生物利用度等數據信息［63-64］。該方法主要應用于致敏性及致敏效力的判斷。與LLNA 結果相比，致敏性判定的準確率為100%，致敏效力分級的準確率為89%。

5.3 堆疊元模型

該方法由法國歐萊雅公司開發，在結合了覆蓋AOP的3個關鍵事件的DPRA法、KeratinoSensTM法和骨髓U937細胞皮膚致敏試驗（bone marrow U937 cell skin sensitization test，U-SENSTM）這3種單一替代方法的基礎上，又增加了兩種分析工具TIME-SS、Toxtree 以及受試物的理化性質，進而結合5 種不同的統計方法組合而成［65］。該模型的判定方式為：對5種不同統計方法給出的數據進行分析后，根據定義閾值判定受試物是否具有致敏性［66］。與單一試驗方法相比，該方法的準確性為93%。

5.4 人工神經網絡分析法

該方法由日本資生堂公司開發，覆蓋了AOP 關鍵事件1～3，同時綜合了受試物的理化性質和計算機模擬參數，構成一個非線性統計模型［67］。該方法將DPRA 法、KeratinoSensTM法、ARE、h-CLAT 法和硫醇基蛋白反應性測試作為單一元素，利用模型對單一元素的不同組合進行回歸分析，判定受試物的致敏性及致敏效力［68］。與LLNA 法相比，該模型的準確性為91%。

6 小結

隨著對皮膚致敏機制的深入研究，從LLNA 法到基于AOP 通路建立的替代試驗，以及基于體內皮膚致敏過程所建立的整合策略已經逐步建立，但目前我們所掌握的AOP 通路還只是很小的一部分，任何體內外替代方法都無法完整模擬致敏后體內的真實反應。因此，建立皮膚致敏替代試驗仍然面臨著巨大的挑戰，尋找能夠模擬出皮膚變態反應整個過程或是關鍵步驟的替代方法將會是未來皮膚致敏替代方法研究的發展趨勢。另一方面，伴隨著基因組學皮膚致敏測試方法的開發，相信不久的將來，皮膚致敏測試方法必將陸續迭代，檢測結果會更加靈敏、準確和快速。

[作者貢獻Author Contribution]

黃靜怡參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關文獻，撰寫初稿并修改；李培寧參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關文獻，參與文稿的修訂；劉香梅共同討論并確定文章主體框架，參與文稿修訂；劉忠華共同討論并確定文章主體框架，并對整體框架給予修改意見；黃宇鋒共同討論并確定文章主體框架，審核初稿并給予修改意見。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。