大鼠腸系膜淋巴液持續引流新方法的初步建立

張笑瑞, 曹 靜, 吳倩倩, 康 康, 陳國元, 吳寶金

(1. 中國科學院分子細胞科學卓越創新中心動物實驗技術平臺,上海 200031; 2. 上海中醫藥大學科技實驗中心實驗動物中心,上海 200031)

腸淋巴系統參與機體免疫細胞運輸［1］、體液平衡［2］、內環境穩態［3］、腸道飽腹感信號的傳遞［4］和膳食脂質的運輸［5］。在病理狀態下，淋巴液中會出現腫瘤細胞和病毒等特異性生物標志物［6-7］，其含量顯著高于外周血［8-9］，通過分析淋巴液有助于了解病理機制并進行早期診斷。自1948年Bollman等［10］首次建立了大鼠腸系膜淋巴液引流技術以來，越來越多的研究者利用該技術開展各種研究。但在引流腸系膜淋巴液時，動物長時間處于麻醉或被限制的狀態［11-13］，導致動物腸系膜淋巴液流速和淋巴轉運能力下降［14］，部分實驗中動物還需接受胃或十二指腸插管手術以補充營養物質，對動物產生額外的損傷，這些因素均會影響腸系膜淋巴系統的研究和該方法的應用。

近年來，有研究者采用一種大鼠膽汁輔助回流裝置，實現了膽汁的實時連續收集，被廣泛應用于消化系統疾病方面的研究［15］。本文采用這種膽汁輔助回流裝置，建立大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術，以實現大鼠在清醒自由狀態下實時、長期收集淋巴液，且能避免手術應激、全身麻醉或動物受限對腸系膜淋巴液形成和組成的影響，從而為腸系膜淋巴系統功能的深入研究提供一種創新的腸系膜淋巴液采集的技術手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠16 只，8 周齡，體質量（250±9）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司［SCXK（滬）2018-0004、SCXK（滬）2019-0001］，質量合格證號為20180004058749、20211221Aazz061900169。所有大鼠均飼養于中國科學院分子細胞科學卓越創新中心實驗動物屏障設施［SYXK（滬）2018-0007］，自由飲食，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，噪聲≤60 dB，生活照明20 lx（12/12 h明暗循環）；全部大鼠每籠不超過3只，適應性飼養7 d后開始實驗。本研究中所有實驗程序經中國科學院分子細胞科學卓越創新中心實驗動物使用與管理委員會審查批準（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045），手術操作均按照《實驗動物護理和使用指南》在超凈工作臺中完成。

1.2 儀器與試劑

體視顯微鏡（SZX16）為日本Olympus 公司產品；微量注射泵（XFP01-BD）為蘇州訊飛科學儀器有限公司產品；全自動血液分析儀XN-1000 為日本SYSMEX（希森美康） 公司產品；大鼠2 通道VAB 系繩（VABR2T/25）、大鼠2 通道血管通路按鈕（VABR2B/25R22）、大鼠2 通道VAB 回路連接器（VABR2L）、PinPort 進樣器（PNP3M）、2 通道轉子（375/D/25LT）、多軸平衡臂（MCLA/MED）、 大鼠采樣籠器具（MTANK/WF） 和 聚 氨 酯（polyurethane，PU） 導 管（BTPU-027、BTPU-040）均購自美國Instech公司，硅膠導管（3 Fr、5 Fr） 購自美國SAI 公司。舒泰50（Zoletil 50） 購自法國Virbac 公司；醫用組織膠水（1469SB）購自美國3M 公司；全血稀釋液CELLPACK DCL，溶血劑Lysercell WNR和LysercellTM WDF，血細胞分析用染色液Fluorocell WNR、Fluorocell WDF 和Fluorocell PLT，清洗液和校準品（XN CAL/XN CAL PF）均購自日本SYSMEX（希森美康）公司；體外診斷試劑干片購自美國Ortho公司。

1.3 實驗分組與模型制備

將16 只雄性SD 大鼠隨機分為2 組（8 只/組）：實驗組和對照組。麻醉狀態下，實驗組行腸淋巴管及頸靜脈雙插管手術，建立大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術模型；對照組行腸系膜淋巴管及十二指腸雙插管手術，建立傳統引流模型。圖1 示大鼠腸系膜淋巴液收集裝置，圖2示大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型建立過程圖。

1.3.1 術前準備

（1）動物術前準備：大鼠術前0.5 h口服灌胃玉米油（5 mL/kg），隨著小腸脂質的吸收產生乳白色的乳糜微粒，定位腸系膜淋巴管［16］。

（2）制備大鼠頸靜脈套管：將5 Fr硅膠管套至PU管（BTPU-027）形成固定扣。制備大鼠腸系膜淋巴管套管：將3 Fr硅膠導管套至PU管（BTPU-040）。用酒精燈加熱PU管尖端，使其成圓弧狀（圖1A）。

圖1 大鼠腸系膜淋巴液收集Figure 1 Collection of rat intestinal lymphatic fluid

1.3.2 實驗組模型制備

（1）腸系膜淋巴管插管：在腹中線上腹部2/3處做3～4 cm的正中切口，打開腹膜腔。用無菌紗布將胃腸臟器推至左腹側腹膜下固定，暴露出左腎靜脈和下腔靜脈區域，此時可觀察到與腸系膜動脈（鮮紅色、有波動感）并行的乳白色腸系膜淋巴管（圖2A）。在體視顯微鏡下分離腸系膜淋巴管（直徑0.5～1 cm），并用動脈夾和結扎線臨時阻斷通路。在淋巴管上方45°角做切口，插入淋巴導管并下行1 cm，此時可見導管中的淋巴液流動，分別固定1 cm 固定扣和淋巴管腸端。取出紗布，將導管呈C 型緊貼于腹壁內側，并將導管4 cm、5.5 cm 和7 cm 處的固定扣固定于腹壁內肌肉（圖2B），臟器位置還原至原始狀態。將導管另一端引導并接入頸部VAB的淋巴管端口。

（2）頸靜脈插管：在頸腹部左側鎖骨區域的皮膚上做0.5 cm 的切口，暴露頸外靜脈，并用動脈夾和結扎線臨時阻斷通路（圖2C）。在血管上方45°角做切口，根據大鼠頸部血管走勢，插入靜脈導管并下行3.5 cm 到達左鎖骨下靜脈處，分別固定導管3.5 cm 處固定扣和頸淺靜脈近心端（圖2D）。將導管另一端引導并接入VAB的頸靜脈端口。完成插管后，將VAB和VAB回路連接器相連（圖2E，圖2F），縫合創口。

圖2 大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型建立過程圖Figure 2 Establishment of auxiliary reflux model of mesenteric lymph

（3）清醒活動裝置連接：將VAB、2 通道VAB 系繩、轉子、多軸平衡臂、采樣籠盒連接，將收集導管放置在淋巴插管的高度（圖1B，圖1C）。

1.3.3 對照組模型制備

（1）腸系膜淋巴管插管：手術位置同實驗組，在腸系膜淋巴管上穿刺并插入導管，組織膠水固定。插管成功后將導管的另一端穿出體外，以收集淋巴液。

（2）十二指腸插管：在幽門下方約2 cm 的十二指腸上穿刺并插入導管，組織膠水固定后，將導管另一端傳出體外連接至微量注射泵，將大鼠放置固定器內（圖1E）。

1.4 淋巴液流量測定

對照組大鼠在術后連續1 h收集腸系膜淋巴液，實驗組大鼠術后恢復7 d 后連續1 h 收集腸系膜淋巴液。收集過程中以3 mL/h 的速度將林格液分別注入十二指腸和頸靜脈管中，對大鼠進行補液［17］。測量單位小時內收集的淋巴液體積，計算腸系膜淋巴液流量。

1.5 淋巴液細胞成分測定

定量提取20 μL 淋巴液與120 μL CELLPACK DCL稀釋液，混勻。使用全自動血液分析儀XN-1000 檢測白細胞總數（total number of white blood cells，WBC）、中性粒細胞數（number of neutrophil，NEUT#）、淋巴細胞數（number of lymphocyte，LYM#）、單核細胞數（number of monocyte，MONO#）、嗜酸性粒細胞數（number of eosinophilia，EOS#）、嗜堿性粒細胞數（number of basophil，BASO#）、中性粒細胞比例（percentage of neutrophil，NEUT/%）、淋巴細胞百分率（percentage of lymphocyte，LYM/%）、單核細胞比例（percentage of monocyte，MONO/%）、嗜酸性粒細胞百分比（percentage of eosinophilia，EOS/%）和嗜堿性粒細胞百分比（percentage of basophil，BASO/%）。

1.6 淋巴液生化成分測定

收集的淋巴液靜置30 min后離心（5 min，3 000 r/min），取得上清液，檢測電解質指標K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+和P3+，物質代謝指標尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CRE）、尿酸（uric acid，URIC）、葡萄糖（glucose，GLU）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL），蛋白水平指標總蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，Alb），以及酸堿指標二氧化碳（CO2）。

1.7 麻醉方法

使用舒泰50 以50 mg/kg 的劑量肌內注射給SD 大鼠，觀察大鼠呼吸頻率降低、肌肉舒張和無疼痛反射后，將其仰臥位置于手術臺上，四肢用膠帶固定。

1.8 數據統計方法

數據分析和繪圖使用GraphPad Prism 8.0 軟件，計量數據以±s表示。淋巴液流量測定數據比較采用配對t檢驗，其余數據比較采用多個樣本t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術模型的效果

行腸淋巴管及頸靜脈雙插管手術建立的大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型與清醒活動裝置組成了一個大鼠腸系膜淋巴液引流系統，該系統在術后第7天仍可以實時收集腸系膜淋巴液。并且，在此期間動物無異常。

2.2 淋巴液流速測定

經測定，實驗組動物腸系膜淋巴液流量為（2.01±0.12）mL/h，對照組流量為（0.92±0.09）mL/h。與對照組相比，實驗組動物腸系膜淋巴液流量顯著升高（P＜0.01）。

2.3 淋巴液細胞成分

與對照組相比，實驗組大鼠淋巴液中LYM#和LYM/%顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），NEUT/%和MONO/%顯著降低（均P＜0.01），其他指標差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 對照組與實驗組大鼠淋巴液細胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

表1 對照組與實驗組大鼠淋巴液細胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：WBC 為白細胞總數，NEUT#為中性粒細胞數，LYM#為淋巴細胞數，MONO#為單核細胞數，EOS#為嗜酸性粒細胞，BASO#為嗜堿性粒細胞，NEUT/%為中性粒細胞比例，LYM/%為淋巴細胞百分率，MONO/%為單核細胞比例，EOS/%為嗜酸性粒細胞百分比，BASO/%為嗜堿性粒細胞百分比。與對照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note: WBC, total number of white blood cells; NEUT#, number of neutrophils; LYM#, number of lymphocytes; MONO#, number of monocytes; EOS#, number of eosinophilia; BASO#, number of baso-phils; NEUT/%, percentage of neutrophils; LYM/%, percentage of lymphocytes; MONO/%, percentage of monocytes; EOS/%,percentage of eosinophilia;BASO/%,percentage ofbasophils.Compared to the control group, ★P＜0.05, ★★P＜0.01.

血細胞分類Blood cell classification WBC/(109·L-1)NEUT#/(109·L-1)LYM#/(109·L-1)MONO#/(109·L-1)EOS#/(109·L-1)BASO#/(109·L-1)NEUT/%LYM/%MONO/%EOS/%BASO/%對照組Control group(n=8)7.48±3.45 0.79±0.42 2.14±1.03 4.54±2.36 0.01±0.01 0.01±0.01 11.20±4.51 28.23±6.78 60.36±9.81 0.15±0.12 0.06±0.07實驗組Experimental group(n=8)14.01±9.93 0.45±0.20 7.34±4.89★6.21±5.09 0.01±0.01 0.01±0.00 4.35±2.16★★51.99±7.40★★43.44±6.61★★0.14±0.15 0.09±0.14

2.4 淋巴上清液生化指標

與對照組相比，實驗組大鼠淋巴液中K+、Na+、CO2、UREA顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），TG和P3+顯著降低（均P＜0.01），其他指標差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 對照組與實驗組大鼠淋巴液生化指標Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

表2 對照組與實驗組大鼠淋巴液生化指標Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：UREA為尿素，CRE為肌酐，URIC為尿酸，GLU為葡萄糖，TG為三酰甘油，CHO 為總膽固醇，HDL 為高密度脂蛋白，TP 為總蛋白，ALB為白蛋白。與對照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note：UREA，urea；CRE，creatinine；URIC，uric acid；GLU，glucose；TG，triglyceride；CHO，total cholesterol；HDL，highdensity lipoprotein；TP，total protein；ALB，albumin. Compared to the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01.

生化指標Biochemical indicators Cl-c/(mmol·L-1)K+c/(mmol·L-1)Na+c/(mmol·L-1)P3+c/(mmol·L-1)Ca2+c/(mmol·L-1)Mg2+c/(mmol·L-1)UREA c/(mmol·L-1)CRE c/(μmol·L-1)URIC c/(mmol·L-1)GLU c/(mmol·L-1)TG c/(mmol·L-1)CHO c/(mmol·L-1)HDL c/(mmol·L-1)TP ρ/(g·L-1)ALB ρ/(g·L-1)CO2 c/(mmol·L-1)對照組Control group(n=8)99.75±1.85 4.75±0.74 136.75±1.48 3.79±0.18 2.65±0.11 0.90±0.13 5.13±0.33 23.56±8.91 37.81±21.46 12.83±3.01 3.63±1.02 1.69±0.16 1.16±0.13 47.05±2.35 24.81±1.91 22.50±2.45實驗組Experimental group(n=8)100.75±1.71 5.74±0.21★★139.63±1.58★★3.49±0.11★★2.66±0.05 0.93±0.07 5.75±0.66★24.61±3.50 51.19±8.85 14.66±1.55 1.57±0.47★★1.62±0.20 1.15±0.15 45.31±1.19 23.51±0.66 27.25±1.09★★

3 討論

3.1 新方法的優勢

文獻［14］報告，國內外學者多選擇在動物術后并處于麻醉或束縛的狀態下收集淋巴液，這雖然縮短了實驗時間，且保證了樣本收集的成功率，但會帶來一些問題：（1）動物在麻醉狀態下會出現胃排空減少、小腸毛細血管通透性改變、淋巴轉運能力下降，本研究中對照組和實驗組的淋巴液流速也證實了這一點；（2）只能間斷地收集淋巴液，不能準確計算出經淋巴轉運藥物的總量，使模型應用受到了限制；（3）為了方便給藥，有學者還要對大鼠進行十二指腸插管，通過導管持續輸注脂質與藥物來評價其經淋巴轉移的能力，然而胃內分泌物以及神經傳導在整個消化過程中發揮關鍵作用，因此在這種病理生理狀態下獲取的數據可能存在偏差；（4）動物飲食受到限制，需要通過皮下注射或胃腸插管輸注營養液來維持動物體液平衡和體能。

本研究中使用的淋巴液收集系統能夠實現大鼠在完全清醒、自由活動、不限制飲食的狀態下，實時并長期收集淋巴液、血液或給藥，避免了手術應激、全身麻醉或動物受限對腸系膜淋巴液形成和組成的影響。該模型具有十分顯著的優勢（表3）：（1）在插管完成后，利用VAB 回路連接器建立一條新的淋巴循環通路，動物可以在愈后健康狀態下開展實驗，避免麻醉、創傷、感染等因素對實驗造成干擾，實現對藥物經淋巴轉運更精確和長期的測量；（2）通過建立淋巴液-血液循環通路，可以根據實驗需求隨時阻斷腸系膜淋巴液，同時結合全自動采血給藥儀，還可以實現完全自動化的淋巴液和血液采集或靜脈給藥；（3）由于淋巴引流的管路呈U 型結構且兩端口的液面一致，根據等高液面壓強相等的原理，此時導管內淋巴液流量等同于腸系膜淋巴管內實際流量，并且在淋巴引流過程中，可以根據淋巴液流速和血液損耗量精準補充等滲離子溶液，維持機體體液平衡和內環境穩態。

表3 大鼠腸系膜淋巴液引流新舊技術對比Table 3 Comparison of novel and traditional techniques for intestinal lymphatic drainage in rats

3.2 淋巴液流速及成分的比較分析

與對照組相比，實驗組動物淋巴液流速顯著升高，這可能與受試動物的體質量、脂質攝入、麻醉或受約束以及感染等生理狀況有關［14，18］。在細胞成分檢測中，實驗組動物的LYMPH#和LYMPH/%顯著升高，推測與動物在麻醉狀態下，胸腺、脾臟和其他中樞淋巴器官的淋巴細胞轉運能力下降有關［14］；并且NEUT/%和MONO/%顯著降低，這可能與對照組動物在術后立即提取淋巴液，機體存在疼痛應激及炎性反應有關［19］。在生化成分檢測中，實驗組動物的電解質指標K+和Na+顯著升高，而P3+顯著降低，這可能與兩組動物對林格液的吸收方式有關；實驗組動物的物質代謝指標UREA 顯著升高，這主要與對照組動物禁食導致蛋白質攝入不足有關；實驗組動物TG顯著降低，這是因為對照組動物在術前口服大量玉米油，經消化分解為TG再轉運至腸系膜淋巴系統；實驗組動物的酸堿指標CO2顯著升高，這可能與麻醉狀態下組織細胞的代謝有關，另一個側面也提示淋巴液呈堿性環境，淋巴液的堿性物質可對抗休克所導致的酸中毒，這可能是淋巴液抗休克的作用機制之一［20］。經驗證，實驗組模型的細胞成分與生化指標均符合大鼠正常生理水平［21］，具有可靠性和可重復性，可以成功取代之前的模型。

3.3 模型制備的注意事項

在腸淋巴插管的位置選擇上，國內外學者的描述較為模糊。很多學者選擇在右腎動脈并行的淋巴管處插管，但該處是腸系膜淋巴管和輔助淋巴管的匯集處，因此收集的淋巴液無法準確評估脂質類藥物經腸道淋巴轉運的真實情況。也有學者選擇切斷這一輔助淋巴管的通路，這增加了手術的難度和風險［17］。本研究中選擇與腸系膜動脈并行的淋巴管，手術難度較低且可以精準收集全部腸系膜淋巴液。同時由于淋巴液和淋巴管呈無色透明狀，通過在術前讓大鼠口服玉米油使其生成乳白色的乳糜微粒［16］，可準確定位腸系膜淋巴管，這主要是因為脂質降解形成的長鏈脂肪酸（14 C～24 C）可與其他脂類產物生成乳白色牛奶狀的乳糜微粒［1，20，22］。對于腹腔內導管的處理方式在不同的研究中也有差異。很多人選擇預留部分導管在腹腔內，以防止導管拉扯而脫離淋巴管，但這容易引發腸道蠕動時與導管發生纏繞，導致大鼠死亡。本研究中將導管呈C 型走位貼于腹腔內壁，結果提示這是維持動物高存活率的又一保障。

腸系膜淋巴管壁非常脆弱，且在分離淋巴管時極容易破壞周邊淋巴組織，從而導致淋巴液回流到乳糜池受阻。因此，該方法對于術者的顯微外科技能要求較高。此外，應選擇一套適合的顯微手術器械和自制導管。顯微器械可精準分離出血管和淋巴管，減少其周圍組織受損。有學者將導管的頭端斜切形成尖銳的角度，雖便于插管，但極易劃傷或刺破管壁，且在抽取體液時，由于導管尖端產生負壓，極易貼合血管或淋巴管內壁，導致導管不通［17］。本研究中自制的導管頭端圓滑，且材質選用醫用級材料，不易出現組織排異。另外在導管固定方面，有學者使用醫用膠水固定插入導管［17］，一方面導管牢固度不明，另一方面膠水會破壞周邊結締組織，甚至會影響局部微循環［16］。在進行腹腔手術時，復原腹腔臟器的位置往往容易被忽略，臟器異位可致動物死亡［16］。由于腸系膜淋巴結分布密集，淋巴液內成分在經過這些多級淋巴結后會如何變化，還有待進一步研究。且腸系膜與小腸是一個有機整體，而小腸的不同部位其消化吸收功能有一定差異，因此，針對不同腸段及淋巴結精準提取其淋巴液的技術尚待進一步優化。

綜上所述，該技術方法可以在大鼠清醒、正?；顒訝顩r下反復、實時收集腸系膜淋巴液，用于脂質、蛋白質、外泌體、電解質及免疫細胞等的定性和定量分析，有助于我們更好地認知腸道毛細淋巴管吸收能力及功能狀態。因此，本研究為腸系膜淋巴液的采集提供了新的技術方法，在涉及腸道淋巴的生理功能、脂溶性藥物吸收、腸道疾病診斷及其機制研究中有很好的應用價值。

［醫學倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有動物實驗通過中國科學院分子細胞科學卓越創新中心實驗動物使用與管理委員會的審核批準（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045）。所有實驗操作均遵照中國科學院分子細胞科學卓越創新中心動物實驗技術平臺發布的《動物實驗技術平臺標準操作規程》的條例進行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Laboratory Animal Use and Management Committee of the Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences（IACUC No. SIBCB-S118340-2112-045）. All experimental procedures were carried out in accordance with the regulations ofStandard Operating Procedures for Animal Experiment Technology Platformsestablished by Animal Core Facility，Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology，Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences.

[作者貢獻Author Contribution]

張笑瑞、曹靜和吳倩倩負責收集資料、實驗設計、實驗操作、數據及論文撰寫；陳國元和康康負責淋巴液的細胞學及生化指標分析，并參與論文撰寫；吳寶金提供研究經費，負責研究方案與論文的審核及修改。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。