抑制磷脂酶D1 活性可促進缺血性腦卒中模型小鼠神經功能恢復

朱彥兵, 白 帆, 陶少鑫, 潘雨花蕾, 王 歡, 趙羽商, 王 崧, 于 艷

(1. 北京市臨床醫學研究所,首都醫科大學附屬北京友誼醫院,北京 100050; 2. 首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經內科,北京 100050; 3. 中國康復研究中心中國康復科學所,北京 100068; 4. 神經損傷與康復北京市重點實驗室,北京 100068)

缺血性腦卒中是威脅人類健康的最主要疾病之一［1］，在我國已成為致死和致殘的首要病因。如何降低神經損傷并且改善卒中預后是腦血管病領域亟待解決的一個問題。目前針對缺血性腦卒中，主要的治療方式有靜脈溶栓、機械取栓以及使用神經保護藥物。靜脈溶栓和機械取栓都有非常嚴格的窗口期，而神經保護藥物的治療作用還需要進一步評估。

越來越多的證據［2］表明，缺血性腦卒中發生后，在缺血低氧等因素的刺激下，自噬相關基因迅速激活，并且隨著腦缺血癥狀的加重，自噬程度會進一步加大，同時促進病灶部位神經元和膠質細胞的不可逆死亡。所以，減輕或者阻斷由急性缺血低氧引發的自噬是實施神經保護的主要手段［3］。這就需要對缺血性腦卒中后自噬發生、發展的規律以及機制進行深入研究，從而為神經保護提供潛在靶點。

自噬的過程從自噬體形成到自噬體與溶酶體融合均與脂類代謝有密切的聯系，因此調控脂類代謝的蛋白可能參與自噬過程的調控［4-5］。據文獻報告，磷脂酶D（phospholipase D，PLD）1 作為調控脂類代謝的關鍵分子之一，參與調控感應細胞內氨基酸濃度的自噬關鍵蛋白即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性，并且在自噬體形成以及自噬體和溶酶體融合過程中發揮關鍵作用［6-8］。而PLD家族的另一主要成員PLD2似乎并不參與自噬的調控［7-8］。本課題組前期研究證實，神經發育過程中PLD1在神經元和星形膠質細胞內都有表達，并且在樹突和樹突棘的發育中發揮關鍵的調節作用［9-10］；進一步研究證實，敲除神經元內PLD1基因抑制其表達可以改善缺血性腦卒中的預后［11］。另有研究發現，PLD1在神經元和星形膠質細胞中均有表達，在血管內皮細胞和小膠質細胞中也有表達［12］。所以，有必要從整體角度觀察抑制PLD1表達對缺血性腦卒中后神經功能的影響，而系統給予PLD1抑制劑是較為便捷和有效的實驗手段。本研究即通過腹腔施予PLD1 抑制劑的方式，觀察缺血性腦卒中發生后病灶組織中自噬指標動態改變和神經功能恢復情況，以期為臨床缺血性腦卒中的治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

PLD 活性抑制劑FIPI（5-fluoro-2-indolyl deschlorohalopemide）（Cat#：528245）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（Cat#：T8877）購自美國Sigma-Aldrich 公司；微管相關蛋白輕 鏈3 （microtubule-associated-protein light-chain-3，LC3） 抗 體（Cat#：L7543） 和β-actin 抗 體（Cat#：A5441） 購 自 美 國Sigma-Aldrich 公 司； PVDF 膜（Cat#：IPFL00010）購自美國Merck公司。ChemiDOCTM XRS+化學發光凝膠成像系統和iMark-TM 吸收光酶標儀為美國Bio-Rad 公司產品，激光共聚焦顯微鏡FV1000（即IX81倒置熒光顯微鏡）及成像分析系統為日本Olympus 公司產品，冷凍切片機為美國Leica Biosystems公司產品。

1.2 動物來源及模型構建

成年雄性C57BL/6 小鼠，8 周齡，共112 只，購自北京華阜康實驗動物有限公司［SCXK （京）2021-0006］， 實驗動物質量合格證編號為110011211100540968。動物飼養于首都醫科大學附屬北京友誼醫院屏障設施［SYXK（京）2017-0019］，飼養環境溫度保持在23 ℃。動物實驗方案經首都醫科大學附屬北京友誼醫院實驗動物福利與管理委員會批準（編號：21-2005），并嚴格遵循首都醫科大學實驗動物管理和使用的相關規章制度。

缺血性腦卒中模型構建步驟參照文獻［11］，即腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠后，通過永久性結扎大腦中動脈遠端，并短暫性地阻斷兩側頸總動脈5 min，造成小鼠大腦皮質局部缺血，且有神經功能缺損癥狀出現，判斷為缺血性腦卒中模型構建成功；假手術組小鼠除不進行大腦中動脈遠端的結扎外，其他操作步驟與缺血性腦卒中模型組相同。

1.3 動物實驗分組

為了解缺血性腦卒中后小鼠病灶組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達變化，將21 只8 周齡成年雄性C57BL/6小鼠隨機分為7組：假手術組，缺血性腦卒中后4 h 組、6 h 組、8 h 組、12 h 組、24 h 組和72 h 組。每組3只。

為評估最佳的PLD 抑制劑濃度及其對小鼠神經功能的影響，將36 只8 周齡成年雄性C57BL/6 小鼠隨機分為6 組：假手術組，缺血性腦卒中后腹腔給予PBS組，缺血性腦卒中后通過腹腔給藥的方式給予不同濃度（0.3、0.9、1.8和3.6 mg/kg［13-14］）的FIPI組；給藥途徑為每天腹腔注射一次，連續7 d。

為觀察FIPI抑制PLD1活性對小鼠病灶組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達及梗死面積的影響，將9 只8 周齡成年雄性C57BL/6小鼠隨機分為3組：假手術組，缺血性腦卒中后立即腹腔給予PBS 組，缺血性腦卒中后立即腹腔給予0.9 mg/kg FIPI 組；給藥途徑為每天腹腔注射一次，連續3 d。

為觀察不同時間窗使用FIPI 抑制PLD1 活性對缺血性腦卒中小鼠神經功能和梗死面積的影響，將36只8 周齡成年雄性C57BL/6 小鼠隨機分為6 組：假手術組，缺血性腦卒中后立即腹腔給予PBS 組，缺血性腦卒中后不同時間（術后立即、術后4 h、術后8 h 和術后12 h［15］）腹腔給予0.9 mg/kg FIPI 組；給藥途徑為每天腹腔注射一次，連續7 d。

1.4 小鼠行為學實驗檢測神經功能變化

小鼠行為學實驗包括貼紙去除實驗（Adhesivesremoval test）和觸須誘發前肢放置實驗（Whisker test）兩種。前者是通過檢測小鼠感知貼于腳掌上貼紙的時間以及去除貼紙的時間，進行行為學分析和評定，判斷小鼠的感覺和運動功能；后者是由于正常動物在觸須后能迅速將對側前肢放置到桌角上，而發生腦缺血后根據損傷的程度不同，損傷側觸須誘導的對側前肢放置功能會有不同程度的受損，因此通過觸須誘發前肢放置實驗可以評估缺血性腦卒中后神經功能變化情況。

所有小鼠在做行為學檢測前都至少在檢測環境內適應0.5 h 以上，防止部分小鼠出現受驚等應激反應，以保證行為學檢測的一致性。在小鼠缺血性腦卒中模型建立前3 d 進行行為學訓練，在建立模型后第1、3和7 天進行行為學測試，以驗證模型建立成功。并在動物模型用藥后，以建模第1、3 和7 天為時間點進行行為學測試，探討FIPI抑制PLD1活性對小鼠神經功能的影響。

1.5 蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白表達

在小鼠缺血性腦卒中模型建立后的不同時間點（4、6、8、12、24和72 h）以及給予PLD1活性抑制劑FIPI 24 h 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠，并進行安死術，取腦缺血病灶組織置于EP 管中。提取組織總蛋白質，用BCA 法定量；取40 μg 總蛋白上樣于10%SDS-PAGE 凝膠上，電壓為150 V，時間為90 min，電泳至目的蛋白分離，再將蛋白條帶轉移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔多克隆LC3抗體和小鼠單克隆β-actin抗體且4 ℃孵育過夜，次日洗膜后分別加入對應的山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗孵育1 h，ECL 光化學法曝光顯影，最后凝膠成像系統拍照統計。以目的蛋白LC3-Ⅱ與內參β-actin 的條帶灰度值之比表示自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的相對表達水平。

1.6 免疫熒光染色法觀察自噬相關蛋白分布

在小鼠缺血性腦卒中模型建立24 h 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠并施行安死術，立即取病灶腦組織并置于干冰上。常規包埋、冷凍切片后，行PBS水化，0.3%Triton X-100/PBS打孔，PBS洗片，然后用10%驢血清室溫封閉1 h。加入兔多克隆LC3 抗體（稀釋比例為1∶500），4 ℃反應過夜；PBS洗片后，加入546 熒光探針標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫避光反應1 h；再PBS 洗片后，用DAPI封固。用共聚焦顯微鏡觀察自噬相關蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的分布情況（反映自噬體的形成過程），即細胞質從彌散狀LC3-Ⅰ分布向聚集狀LC3-Ⅱ改變則判斷為自噬發生。

1.7 TTC染色法檢測腦梗死面積

根據TTC 染色出現的顏色變化可以區分缺血灶區域（白色）和正常組織區域（紅色）。在小鼠缺血性腦卒中模型建立3 d 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠并施行安死術，立即取病灶腦組織；然后行冷凍切片，每片厚度約1 mm；將切好的腦片置于已預熱的盛有2%TTC 的溶液中，放于37 ℃水浴鍋中5 min；染色完成后，倒掉TTC溶液，加入質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定24 h；常規掃描儀掃描后用Image J 軟件分析統計各組小鼠腦皮質梗死情況，即用Image J 軟件圈出不同切片中的梗死范圍，經軟件自動計算出圈出的梗死面積。假手術組由于沒有病灶，所以不做TTC染色。

1.8 統計方法

應用GraphPad Prism 7軟件對各實驗結果數據進行統計學分析。所有數據以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 缺血性腦卒中后自噬發生特征

蛋白質印跡法檢測缺血性腦卒中發生后小鼠腦缺血病灶組織內自噬相關蛋白LC3 的相對表達水平，結果如圖1A～B 所示。缺血性腦卒中發生后，LC3-Ⅱ/β-actin 的比值緩慢升高，在缺血性腦卒中發生后24 h達到峰值，在缺血性腦卒中發生后72 h 下降到假手術組水平。統計學分析結果顯示，假手術組與缺血性腦卒中發生后24 h 組之間LC3-Ⅱ/β-actin 比值差異有統計學意義（P＜0.05）。

通過免疫熒光染色觀察小鼠腦缺血病灶組織內自噬相關蛋白LC3的分布情況（反映自噬體形成），結果如圖1C～D 所示。缺血性腦卒中發生后24 h 病灶組織內彌散型LC3-Ⅰ明顯轉變為聚集狀膜型LC3-Ⅱ，提示自噬發生。

圖1 蛋白質印跡法（A～B）和免疫熒光染色法（C～D）檢測缺血性腦卒中小鼠病灶組織中自噬相關蛋白LC3的表達情況Figure 1 Expression of autophagy-related LC3 in the infracted cortex after ischemic stroke detected by Western blotting(A and B)and immunofluorescent staining(C and D)

2.2 抑制PLD1可明顯促進神經功能的恢復

缺血性腦卒中小鼠建模后用不同濃度的PLD 抑制劑FIPI 腹腔給藥，通過貼紙去除實驗和觸須誘發前肢放置實驗觀察小鼠行為學變化，以此反映小鼠神經功能的恢復情況，結果如圖2 所示。統計學分析結果顯示，與假手術組相比，缺血性腦卒中小鼠給予PBS 組的貼紙持續時間明顯延長，前肢觸發成功率明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示缺血性腦卒中模型構建成功，小鼠神經功能明顯被抑制。而與PBS組相比，缺血性腦卒中小鼠給予0.9 mg/kg FIPI 后貼紙持續時間明顯縮短，前肢觸發成功率明顯提高，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示0.9 mg/kg FIPI 腹腔給藥能明顯促進缺血性腦卒中小鼠的神經功能恢復。因此，后續實驗中使用質量濃度為0.9 mg/kg 的FIPI 抑制PLD活性。

2.3 抑制PLD1 可明顯抑制缺血性腦卒中發生后病灶組織的自噬

通過蛋白質印跡法檢測缺血性腦卒中發生后抑制PLD1 活性對自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達的影響，結果如圖3A～B 所示。統計學分析結果顯示，缺血性腦卒中發生后，與PBS 組相比，給予0.9 mg/kg FIPI 抑制PLD 活性可以明顯下調小鼠病灶腦組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的相對表達水平，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 抑制PLD1 可明顯縮小缺血性腦卒中小鼠的梗死面積

通過TTC 染色評估即刻給予0.9 mg/kg FIPI 抑制PLD1活性對缺血性腦卒中小鼠梗死病灶的影響，結果如圖3C～D 所示。構建缺血性腦卒中小鼠模型后，與PBS 組相比，FIPI 組小鼠的梗死病灶面積明顯縮小，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示造模后即刻給予FIPI具有減弱缺血導致腦梗的作用。

2.5 延遲抑制PLD1 也可以明顯改善小鼠的神經功能

在缺血性腦卒中發生后的不同時間窗即0 h、4 h、8 h 和12 h，腹腔給予0.9 mg/kg FIPI 抑制PLD1 活性后通過貼紙去除實驗和觸須誘發前肢放置實驗檢測小鼠神經功能恢復情況，結果如圖4 所示。除缺血性腦卒中發生后第7 天的貼紙去除實驗結果沒有明顯差異外（圖4C），與缺血性腦卒中發生后給予PBS 組相比，缺血性腦卒中發生后0 h、4 h、8 h 和12 h 給予FIPI 用藥后的小鼠貼紙持續時間均明顯縮短，前肢觸發成功率明顯提高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），提示0～12 h時間窗的FIPI用藥均可明顯促進小鼠神經功能恢復。

圖4 行為學實驗顯示缺血性腦卒中后不同時間點給予0.9 mg/kg抑制劑FIPI均可以明顯促進神經功能的恢復Figure 4 Behavior tests reveal the administration of 0.9 mg/kg FIPI at different time points after ischemic stroke can improve the neurological function of mice

2.6 延遲給FIPI亦明顯減少缺血性腦卒中小鼠的梗死面積

通過TTC 染色評估缺血性腦卒中發生后4 h、8 h 和12 h 給予0.9 mg/kg FIPI 抑制PLD1 活性對缺血性腦卒中小鼠梗死病灶的影響，結果如圖5 所示。建立缺血性腦卒中小鼠模型后，與PBS 組相比，不同時間窗給予FIPI 治療后第3 天的小鼠梗死病灶面積均明顯縮小，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 TTC染色觀察缺血性腦卒中發生后不同時間點給予0.9 mg/kg抑制劑FIPI縮小小鼠腦梗死面積Figure 5 TTC staining reveals the administration of 0.9 mg/kg FIPI at different time points after ischemic stroke can reduce the volume of infarcted cortex of mice

3 討論

細胞自噬是一種由溶酶體介導的高度保守的降解過程，在營養缺乏、細胞器老化和活性氧堆積等條件下，細胞通過形成雙層膜結構的自噬小體，包裹一部分胞內物質并將其運送到溶酶體進行降解或者重新利用［16］。在正常生理情況下，自噬可以降解老化的細胞器以維持細胞內穩態。在病理條件下，通過自噬降解部分細胞器可以保證主要細胞器功能的維持。細胞接受內外自噬信號后，形成自噬體，之后可與實現細胞內吞作用的吞噬泡、吞飲泡和內體融合，繼而與溶酶體融合形成自噬泡，自噬體內容物被溶酶體內的水解酶降解。但是在疾病、外界壓力、饑餓、低氧和內質網應激等特殊情況下，各種刺激信號引發的自噬就不再是細胞自保的手段，而是會促進細胞的不可逆死亡，所以預防自噬也是治療相關疾病的主要手段之一［17］。另外，LC3 是自噬相關標志性蛋白，其有兩種表達形態：LC3-I 和LC3-Ⅱ。正常條件下，細胞中LC3-I 為主，為彌散狀分布；發生自噬時，LC3-Ⅱ為主，為聚集狀分布。自噬體的形成過程也是細胞質內彌散型LC3-Ⅰ轉變為聚集狀膜型LC3-Ⅱ的過程，所以觀察LC3 不同形態的轉變是檢測自噬是否發生的金標準。研究者往往可以通過電子顯微鏡觀察LC3的分布形態，或者采用蛋白質印跡法檢測LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ或內參的比值變化來分析自噬的發生情況［18］。本研究中，主要通過蛋白質印跡法觀察病灶組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ與內參β-actin 的比值變化來分析PLD1 對缺血性腦卒中發生后病灶組織自噬的影響。

有研究運用在體成像技術觀察GFP-LC3轉基因小鼠腦缺血后LC3 的表達特征，發現隨著腦缺血癥狀的加重，LC3熒光表達量逐漸增強，腦缺血后1 d病灶部位的LC3熒光強度達到峰值［18］；本研究結果與該文獻報告相符。此外，本研究中蛋白質印跡法檢測證實缺血性腦卒中發生后24 h病灶組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的相對表達水平最大，提示缺血性腦卒中后24 h 是自噬發生的高峰。同時免疫熒光染色證實，缺血性腦卒中發生后24 h病灶組織細胞內彌散型LC3-Ⅰ明顯轉變為聚集狀膜型LC3-Ⅱ。

本課題組前期研究證實，通過構建條件性敲除小鼠，特異性地敲除神經元內PLD1的表達可以緩解缺血性腦卒中后神經功能的損傷［11］。但也有研究證實，缺血性腦卒中發生后，病灶部位的星形膠質細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞和血管內皮細胞等也會發生明顯的自噬，但不同類型的細胞發生自噬的時期和作用還需要進一步研究觀察［2，19］。本課題組前期研究發現，生理情況下，PLD1在神經元和星形膠質細胞中都有表達［9-10］。鑒于此，從整體角度闡明缺血性腦卒中后病灶組織自噬的規律非常重要。本研究主要觀察缺血性腦卒中發生后病灶組織的自噬規律，并且通過腹腔給予抑制劑FIPI抑制PLD1的活性，觀察發現這有利于促進缺血性腦卒中后神經功能的恢復。需要說明，本研究并沒有觀察缺血性腦卒中后不同時期具體哪種細胞類型發生自噬以及自噬的特點，在后續實驗中需要先觀察缺血腦卒中發生后早期、中期和晚期自噬細胞的類型以及自噬規律，然后在構建不同細胞類型的條件性敲除小鼠時，敲除包括PLD1在內的自噬相關蛋白將會進一步闡明不同類型細胞自噬在缺血性腦卒中發生發展中的作用。

PLD1在自噬體形成過程中發揮重要作用。例如在帕金森病的發生發展中，PLD1具有調控自噬流和清除突觸核蛋白（α-synuclein）聚集的作用；同時還證實，抑制PLD1 后α-synuclein 聚合物會大量聚集在人類成神經細胞瘤SH-SY5Y 分化細胞中，最終導致細胞死亡［4，20-22］。本研究證實PLD1 和自噬的關系非常密切。而同樣作為磷脂酶D家族重要成員之一的PLD2卻鮮有和自噬相關的報告，主要原因可能在于PLD1和自噬相關蛋白LC3共定位，在細胞質內彌散型LC3-Ⅰ轉變為聚集狀膜型LC3-Ⅱ的過程中發揮關鍵作用，而PLD2并不和LC3 共定位。因此大多數情況下，通過廣譜抑制劑FIPI 干預PLD 活性可達到調控自噬的目的。另有研究顯示，抑制PLD2可以緩解阿爾茨海默病發生過程中β樣淀粉蛋白對神經元的損傷［23］，但其具體機制還需要進一步探討［24］。本課題組前期進行的缺血性腦卒中后不同時間點組織測序結果也證實，缺血性腦卒中后病灶組織中PLD1 表達明顯上調，但PLD2 表達基本沒有變化，提示PLD1 比PLD2 在缺血性腦卒中后自噬過程中發揮更重要的功能。但與上述研究報告中PLD1對帕金森病發生的作用不同，本研究證實在缺血性腦卒中發生過程中抑制PLD1可促進神經功能恢復，提示在不同疾病中自噬發揮不同功能。

此外，本研究通過貼紙去除實驗和觸須誘發前肢放置實驗來評估缺血性腦卒中后神經功能的恢復情況，結果顯示兩種行為學表現有差異，這可能和本研究所用的模型有關。本研究使用的是大腦中動脈遠端結扎模型［11，25］，此模型利用了嚙齒類動物桶狀皮層特征，觸須神經沖動的傳入通過“觸須-丘腦-桶狀皮質（Barrel Cortex）”途徑的腦區，該模型能夠模擬較為精確的點對點方式聯系的損傷，所以觸須誘發前肢放置實驗結果可能比貼紙去除實驗結果更為準確。另外，還有可能與實驗的樣本只數有關系，在后續實驗中將通過增加樣本量以更加準確地評估動物行為學的變化。

目前針對缺血性腦卒中的治療主要是采取早期組織多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA）靜脈溶栓和介入取栓，這兩種治療方式的療效都受限于非常狹窄的窗口期，因此延長缺血性腦卒中的治療窗口期對于其治療至關重要。本研究發現，在缺血性腦卒中后的4 h、8 h和12 h抑制PLD1活性均可以縮小缺血梗死面積，并促進神經功能恢復。FIPI 作為FDA 批準的抗腫瘤藥物，主要是通過抑制PLD 促進腫瘤細胞轉移的功能發揮作用，因此推測運用FIPI 可通過抑制PLD活性達到治療缺血性腦卒中的目的。本研究證實，FIPI 抑制PLD 活性可以緩解缺血性腦卒中小鼠的神經損傷，并且能明顯拓寬治療的窗口期，這為FIPI“老藥新用”提供了一定的理論依據。

綜上所述，本研究通過動物行為學、蛋白質印跡和TTC 染色證實，自噬是導致缺血性腦卒中發生后神經損傷的重要原因之一，通過抑制小鼠缺血性腦卒中后神經元內的PLD1活性可以有效減少神經元自噬，縮小梗死面積，改善神經功能。但是缺血性腦卒中后PLD1誘導的自噬以及不同時期自噬的細胞類型及具體機制還需進一步探索?？傊?，本研究為臨床治療缺血性腦卒中提供了新的實驗依據和治療思路。

［醫學倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有動物實驗均已通過首都醫科大學附屬北京友誼醫院實驗動物福利與管理委員會批準（項目批準號：21-2005）。所有實驗過程均遵照實驗動物相關法律法規條例要求進行。

All animal experiments in this study were approved by the Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Beijing Friendship Hospital of Capital Medical University(Approval Letter No. 21-2005). All experimental protocols followed the guidelines of experimental animal-related laws and regulations.

[作者貢獻Author Contribution]

朱彥兵負責課題設計、蛋白質印跡實驗、文章撰寫及修改；白帆負責蛋白質印跡實驗和文章撰寫；陶少鑫和潘雨花蕾負責缺血性腦卒中小鼠模型構建；王歡、趙羽商和王崧負責行為學實驗和數據收集；于艷參與課題設計和論文把關。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。