井下煤礦工作不育患者的精子質量及輔助生殖妊娠結局研究*

管福來 董業浩 曹井賀 梁魯南 劉貞輝 孫寶剛**

1.濰坊醫學院形態學實驗室(山東 濰坊 261053);2.濟寧醫學院附屬醫院(山東 濟寧 272029)

濟寧作為傳統的煤礦產區,在不孕不育日常診療過程中,從事井下工作的男性不育患者占有一定的比例,作為一種特殊的職業群體,煤礦工人的身心健康引起了社會和企業的關注,并進行了大量的研究工作[1-3]。 但此類工作與男性不育關系的研究較少,并且井下煤礦工作對體外受精-胚胎移植的治療結局的影響鮮有報道,基于以上研究背景,通過分析井下煤礦工作患者精液質量及其精子功能、輔助生殖妊娠結局以及后代情況,探討井下煤礦工作對精液質量、精子功能、輔助生殖妊娠結局以及出生后代的影響,為臨床上對此類患者進行生育能力評價、治療措施的選擇、妊娠結局的預測、對子代的影響等提供依據。

一、資料與方法

(一)研究對象

回顧分析濟寧醫學院附屬醫院生殖醫學中心56例從事井下煤礦工作1 年以上、因妻子輸卵管因素行輔助生殖助孕男性患者作為實驗組,將103 例正常生育男性、因妻子輸卵管因素行輔助生殖助孕者作為對照組。 所有周期均為第一次治療周期,所有患者進行助孕治療前均經過詳細的一般情況檢查、體格檢查、內分泌檢查、遺傳學檢查和至少兩次精液分析。 對進入研究的對象嚴格篩選,排除以下因素:①具有嚴重生殖系統異常的患者;②女方存在其他不孕原因,發現已知的影響輔助生殖助孕妊娠結局的疾病,(其通過子宮輸卵管造影或者宮腔鏡、腹腔鏡手術以及超聲檢查證實);③男方存在遺傳性疾病;④伴有泌尿生殖系統外科疾病;⑤有特殊用藥史(如激素類、細胞毒藥物);⑥有特殊職業暴露史(如毒物、高強輻射、化工、農藥、高溫、高濕等);⑦有不良生活史(如吸煙＞10 支/天、酗酒、電腦接觸＞8h/天等)。

(二)方法

1.精液常規分析

(1)計算機輔助精子分析(CASA):采用計算機輔助精子分析儀(西班牙,SCA)檢測精子密度、總數、各級運動精子百分率和數量等。

(2)精子形態學分析(Diff-Quik 法):精子形態畸形率=畸形精子數/計數精子總數×100%

2.精子功能檢查

依照WHO 技術規范采集、處理和檢測精液標本,檢測實驗組與對照組相關精子指標水平。 精子-透明質酸結合率;精子核蛋白不成熟率;精子DNA 碎片率。

(1)精子頂體酶活性檢測:使用精子頂體染色試劑盒(PSA-FITC,深圳華康生物)檢測精子頂體酶活性,簡要步驟如下:測定精液常規參數后,測定和對照Ep 管中加入7.5×106個精子,離心去除精漿,按照試劑盒使用說明操作,依次加入相關試劑,水浴后離心,紫外分光光度計讀取各管405nm 的OD 值,計算頂體酶活性。

(2)精子核蛋白組型檢測(苯胺藍染色法,深圳華康生物)利用洗滌液稀釋精子濃度至40×106/mL 對于小于該濃度的樣本進行離心濃縮)。 取上述調整后的精液1mL 加Eppendorf 管內,1000×g 離心10min,去除精漿。 加1mL 洗滌液,充分混勻。 1000×g 離心3min 去上清液,如此共洗滌3 次。 最后一次離心棄上清液后,加1mL 粘合液。 取5μl 調整后的精液涂片,空氣干燥。加固定液固定90s,甩去固定液。 玻片以自來水輕輕沖洗7 次,甩去玻片表面積水,加染液覆蓋膜片區,染色5min。 以自來水緩緩沖洗,然后將膜片浸泡至洗脫液中準確脫色18 ～20min,或至膜片無明顯藍色為止。 立即甩去脫色液,以自來水快速洗滌7 次。 迅速吹干或晾干后加封固液1 滴,以蓋玻片封片。 油鏡計數200 個精子,不成熟核蛋白組型轉換異常精子頭部呈藍色,計算頭部著色精子百分率。

(3)精子DNA 碎片檢測[精子染色質擴散實驗(SCD)法,深圳博銳德生物科技有限公司]。 檢驗方法:①試劑及室溫準備:將易熔凝膠管置于80℃孵育20min,待完全融化后,將易熔凝膠管置于37℃待用。檢測前將室溫調整至20 ～28℃。 ②標本制備:將液化的新鮮精子濃度用生理鹽水調整至(5 ～10)×106/mL。③檢測方法:嚴格按照試劑盒使用說明給出的檢測方法進行檢測。 ④精子DNA 碎片判定標準:精子頭部僅產生較小的光暈或無光暈,單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。 SDF(%)= 存在DNA 碎片精子數/被觀察精子總數×100%。

(4)精子-透明質酸結合率檢測(深圳博銳德生物科技有限公司):將10μl 液化的精液加入透明質酸包被的載玻片(測定孔)“T”孔中后待精液自然擴散到(對照孔)“C”蓋上蓋玻片孔;室溫放置10min 后,在400 倍顯微鏡下觀察精了與玻片上的透明質酸結合情況,計數500 個活動精了,精了-透明質酸結合率(%)=(“T”孔被結合精了數/“T”孔計數活動精了總數-“C”孔被結合精了數/“C”孔計數活動精了總數)×100%。

3.臨床操作

(1)控制性超促排卵:實驗組與對照組女方均選擇長方案超促排卵:于啟周期前次月經黃體中期肌注GnRH-α(促性腺激素釋放激素激動劑),達菲林1.33mg,月經第3 天開始使用GnRH-α 促排卵,月經第6 天起,行陰道B 超檢查卵泡和子宮內膜發育情況,并以此及時調整用藥。 直至有2 ～3 個主導卵泡直徑在18mm 以上時,結合激素檢測結果提示卵泡發育成熟,停用促排卵藥物,于當晚8 點注射hCG5000 ～10000u。注射hCG(人絨毛膜促性腺激素)后34 ～36 小時在陰道B 超引導下穿刺取卵,記錄取卵數。

4.胚胎實驗室操作

(1)精子處理:為了減少或者去除精漿的抗精子抗體,細菌,免疫活性細胞、雜質,達到符合要求的精子濃度,促進精子獲能,改善精子受精能力等,將實驗組與對照組在授精前須對精子進行必要的處理。 采用密度梯度分離法分離:其具體步驟為:取精子密度梯度分離培養基,吸取1mL 下層(高密度)分離培養基置于離心管中,再吸取1mL 上層分離培養基(低密度)緩慢地注于下層分離培養基的上面。 兩層培養基的中間形成一個清晰的界面,37℃培養箱復溫。 小心吸取1mL 培養基化的精液覆蓋于上層分離培養基的液面。 以(300 ～600)×g 的速度離心20min。 移去所有的分層溶液,只剩底部的沉淀。 加2 ～3mL 洗精培養基,將沉淀混勻。200×g 離心5min。 移去上清,再加入洗精培養基,重復離心洗滌步驟。 用0.5mlIVF 受精培養基沉淀。 進行精子計數和精子質量評估。 將處理獲得的精子調整密度(50 ～300)×103/mL 為宜,后置5%CO2、37℃、95%濕度培養箱待用。

(2)受精及胚胎培養:實驗組、對照組采用常規的體外受精。 受精后18h 觀察原核,出現2 個原核和2 個極體為正常受精卵,未出現2PN 為受精完全失敗。 取卵后培養72h 觀察胚胎形態,將優質胚胎移植到宮腔內。 胚胎移植后14 天檢測尿或血HCG 陽性,移植后4 ～5周超聲檢查見胎心搏動為臨床妊娠。 移植時先選擇常規受精來源的胚胎,若無常規受精來源胚胎則移植ICSI 受精胚胎。

(3)胚胎按以下評分標準分級:

胚胎以形態學指標分級:4'-卵裂球大小均勻,碎片為≤5%;3'-卵裂球大小均勻或不等,碎片6% ～20%;2'-卵裂球體積相等或不等,碎片21% ～50%;1'-卵裂球少,碎片＞50%。 1、2 級胚胎在發育過程中出現下列情況,胚胎評級時在形態學基礎上降一級:①授精20h 內未見到原核,48h 證實為延遲受精的胚胎。 ②取卵后48h超過8 細胞或72h 未超過5 細胞。 正常受精4、3 級胚胎為優質胚胎。

5.計算公式:受精率=正常受精卵數/卵-冠-丘復合體數×100%;優質胚胎率=優質胚胎數/卵裂數×100%;著床率=B 超觀察到的妊娠囊數/移植胚胎數×100%;臨床妊娠率= 臨床妊娠例數/移植周期數×100%;生化妊娠率=生化妊娠周期數/妊娠周期數;流產率=孕28 周前流產周期數/臨床妊娠周期數;早產率=發生妊娠≥28 足周至≤37 足周的早產分娩數/產婦總數×100%。

(三)統計學處理

實驗數據采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。 計量資料用±s表示,比較采用單項方差分析;計數資料用率(比值)表示,比較應用卡方檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義,P＜0.01 差異有顯著統計學意義。

二、結果

(一)實驗組與正常組一般資料比較(表1)

比較實驗組與對照組患者:男、女方年齡、不孕年限、竇卵泡數、女方基礎FSH、LH、HCG 日E2、HCG 日子宮內膜厚度差異無統計學意義(P＞0.05),見表1。

表1 實驗組與對照組一般資料比較

(二)比較實驗組與對照組患者精液質量比較

實驗組與對照組相比,精液參數中,精液量、精液濃度無統計學意義(P＞0.05)。 對照組前向運動率、精子活動率、正常形態率組高于實驗組,差異有統計學意義(P＜0.05),見表2。

表2 實驗組與對照組患者精液質量比較

(三)實驗組與對照組患者精液功能比較

對比實驗組及對照組精子功能指標發現:實驗組頂體酶活性、精子-透明質酸結合率與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05),實驗組的DNA 碎片、核蛋白組型高于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05),見表3。

表3 實驗組與對照組患者精液功能比較

(四)實驗組與對照組輔助生殖結局的比較

對照組的受精率、優質胚胎率高于實驗組,差異有統計學意義(P＜0.05),實驗組的卵裂率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率與對照組相比差異無統計學意義。(P＞0.05)。 見表4

表4 實驗組與對照組輔助生殖結局的比較

(五)實驗組與對照組輔助生殖子代的比較

實驗組的流產率、出生體重、早產率、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。 見表5。

表5 實驗組與對照組輔助生殖子代的比較

討 論

煤礦工作生產過程中,可能會產生高溫、噪音,震動、煤塵和化學毒物等職業危害,同時可能對心理健康產生不利影響,高溫會引起睪丸內環境、代謝、免疫反應及生精微循環的改變,從而引發睪丸生精障礙、精液質量下降,最終導致男性不育,使精液質量下降[4-5]。另有研究顯示[6-8]:長期暴露在噪音振動職業工作環境下的工人則表現為,精子活力降低,畸形率升高等男性不育的表現。 此外,長期接觸煤塵以及微量的有毒有害物質和放射性物質對男性生殖健康都會造成嚴重的影響[9]。 同時長期高強度的工作加之井下作業的復雜生產環境,其中存在的粉塵、噪聲、震動、高溫、高濕的生產組織方式和不良體位等職業危害因素也在很大程度上影響著煤礦井下作業人員的身心健康,使他們承受著巨大的心理壓力。 長期負性情緒可使機體內分泌和免疫系統發生功能紊亂,可以導致性功能和生殖功能障礙,造成精子質量下降,引發男性不育[10-11]。

本研究結果顯示,從事井下煤礦工作的不育患者的精液參數中,精液量、精子濃度與正常生育男性相比無統計學意義。 而從事煤礦的不育患者的前向運動精子率、精子活動率、正常形態率組高于實驗組,差異有統計學意義。 從事煤礦的不育患者的頂體酶活性、精子-透明質酸結合率與對照組相比差異無統計學意義,實驗組的DNA 碎片、核蛋白組型大于對照組,差異具有統計學意義;這與胡麗麗等的[12]研究相似。 這說明從事煤礦工作的工人長期受到高溫、噪音,震動、煤塵和化學毒物等多重不良因素的影響,對其男性生精功能會產生損傷,最終會導致男性不育的發生,具體表現在精子質量的下降,精子功能的損傷等。

作為有可能導致男性不育的煤礦井下工作,目前關于其對體外受精-胚胎移植的治療結局的影響卻鮮有報道。 我們的研究顯示:從事井下煤礦工作的不育患者的受精率、優質胚胎率低于對照組,差異有統計學意義。 井下煤礦工作的不育患者的卵裂率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率與對照組相比差異無統計學意義。井下煤礦工作的不育患者的子代影響指標與對照組相比。 實驗組的流產率、出生體重、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率與對照組相比差異無統計學意義。 而導致井下煤礦工作的不育患者的受精率、優質胚胎率低于正常生育的原因可能是由于精子質量影響輔助生殖結局[13-14],而長期從事煤礦工作會導致患者精子活力下降,精子畸形率升高,可能影響精卵結合及胚胎質量,從而導致受精率和優質胚胎率降低[15]。

我們研究發現井下煤礦工作對男性精液質量、精子功能及輔助生殖結局都有一定的影響。 這需要從事煤礦工作人員應加強自我防范意識,同時煤礦企業也應加強對井下煤礦工人的勞動保護。 但由于本研究樣本偏少,結論可能具有一定局限性,還有待于大樣本隨機對照實驗證實。