超高效液相色譜-電霧式檢測器測定福建產絞股藍中絞股藍皂苷XLVI和LVI

盧彭信, 李 港, 鄭 偉, 梁海珍, 張 潔,柴瑞平, 羅定強, 金 燕, 郭寶林, 馬百平*

(1. 廣東藥科大學中藥學院, 廣東 廣州 510060; 2. 軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所, 北京 100850;3. 賽默飛世爾科技(中國)有限公司, 上海 201206; 4. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所, 北京 100193; 5. 陜西省食品藥品檢驗研究院, 陜西 西安 710065)

絞股藍尚未收錄至2020版《中國藥典》,僅收錄于地方標準,如在《福建省中藥材標準(2006年)》中,對絞股藍的質量控制僅局限于性狀、色味,對絞股藍總皂苷或具體皂苷無明確的含量控制。根據文獻調研發現[17-20],目前關于絞股藍質量控制的液相色譜法,多采用紫外(ultraviolet, UV)檢測器測定絞股藍中一種或多種皂苷的含量。然而皂苷類化合物通常無紫外吸收或僅為末端吸收,UV對于這類化合物的檢測不穩定,靈敏度低,并且在梯度洗脫時容易出現基線漂移。電霧式檢測器(charged aerosol detector, CAD)是一種質量相關的通用型檢測器[21],對比其他通用型檢測器如蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector, ELSD)和示差折光檢測器(differential refractive index detector, RID), CAD具有靈敏度更高[22]、重現性更好和檢測范圍更寬[23]等特點,其檢測信號不依賴于被測物質的化學結構,更適用于無紫外吸收或只有較弱紫外吸收成分的定量分析[24]。

本研究利用UHPLC-Q-TOF/MS結合UHPLC-CAD鑒定了福建產絞股藍的主要成分,經過堿水解后[25],絞股藍皂苷XLVI(gypenoside XLVI)和絞股藍皂苷LVI(gypenoside LVI)含量遠高于其他皂苷成分,為福建產絞股藍中的主成分,適合作為福建產絞股藍質量評價的指標成分,且目前缺少相關報道。因此,本研究利用UHPLC-CAD建立了福建產絞股藍中絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量測定方法,為福建產絞股藍藥材的質量評價和標準制定提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish Flex UHPLC液相色譜儀、CAD檢測器(美國Thermo Fisher公司); Waters ACQUITY I-Class超高效液相色譜系統、VION-IMS-Q-TOF質譜系統(美國Waters公司); BP 211D十萬分之一天平(德國Sartorius公司); KQ-600DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈(質譜純,美國Thermo Fisher公司);蒸餾水(廣州屈臣氏有限公司);無水乙醇(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。對照品絞股藍皂苷XLVI和LVI由本課題組從福建產絞股藍中分離得到,經HR-ESI-MS以及1H-NMR、13C-NMR等波譜分析鑒定結構,經UHPLC-CAD面積歸一化法測得純度均大于98.0%,結構式如圖1所示。

圖 1 絞股藍皂苷XLVI和LVI的結構式Fig. 1 Structures of gypenoside XLVI and LVI

圖 2 絞股藍樣品的(a) UHPLC-CAD分析色譜圖和(b) UHPLC-Q-TOF/MS分析基峰圖Fig. 2 (a) Chromatogram of UHPLC-CAD and (b) base peak ion chromatogram of UHPLC-Q-TOF/MS of Gynostemma pentaphyllum sample Peak identifications 1-8 were shown in Table 2. CAD: charged aerosol detector; Q-TOF/MS: quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.

藥材來源信息見表1, 16份樣品均來自福建絞股藍主產區,經中國醫學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍。所有藥材經烘箱50 ℃干燥至恒重后,粉碎,過40目篩得樣品粉末,干燥陰涼處儲存備用。

表 1 絞股藍樣品信息Table 1 Information of Gynostemma pentaphyllum samples

表 2 絞股藍樣品中主要的化學成分Table 2 Main compounds in Gynostemma pentaphyllum samples

1.2 定性分析

1.2.1定性分析樣品的配制

稱取絞股藍皂苷XLVI和LVI對照品粉末適量,分別溶解于乙醇-水(70∶30, v/v)中,各吸取一定體積均勻混合,0.22 μm微孔濾膜過濾即得對照品溶液。

精密稱取絞股藍樣品粉末0.2 g,加入乙醇-水(70∶30, v/v)30 mL于具塞錐形瓶中,超聲提取30 min,取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

1.2.2定性分析的液相色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為乙腈。梯度洗脫條件:0～2 min, 10%B～25%B; 2～7 min, 25%B～32%B; 7～10 min, 32%B～33%B; 10～12 min, 33%B～35%B; 12～22 min, 35%B～46%B; 22～27 min, 46%B～56%B; 27～28.5 min, 56%B～95%B; 28.5～30 min, 95%B; 30～30.5 min, 95%B～10%B; 30.5～33 min, 10%B。流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣體積2 μL。

1.2.3飛行時間質譜條件

電噴霧電離(ESI)源,負離子模式,離子源溫度為110 ℃,脫溶劑氣體為氮氣,流速為850 L/h,溫度為450 ℃，毛細管電壓為2.5 kV,錐孔電壓為50 V,低能量掃描時能量為6 eV,高能量掃描時能量為35～65 eV，掃描范圍為m/z100～1 500。精確質量數用亮氨酸-腦啡肽(leucine-enkephalin)溶液進行校正。

1.3 含量測定

1.3.1對照品溶液的配制

分別精密稱取對照品粉末絞股藍皂苷XLVI和LVI適量,用乙醇-水(50∶50, v/v)溶解,于10 mL容量瓶中定容,制得質量濃度分別為1.272 mg/mL和1.636 mg/mL的對照品儲備溶液,4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2供試品溶液的配制

精密稱取樣品粉末0.2 g,置于100 mL具塞磨口錐形瓶中,加入30 mL乙醇-水-氨水(50∶46∶4, v/v/v),密塞,超聲提取30 min(功率600 W,頻率40 kHz),靜置24 h,稱重比較前后重量差異,加入提取溶劑補足減失的量,取1 mL上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

1.3.3含量測定的液相色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為乙腈。梯度洗脫條件:0～10.4 min, 30%B; 10.4～10.5 min, 30%B～95%B; 10.5～14.5 min, 95%B; 14.5～14.6 min, 95%B～30%B; 14.6～20 min, 30%B。流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣體積2 μL; 電霧式檢測器采集頻率10 Hz,蒸發溫度35 ℃,濾波1 s。

2 結果與討論

2.1 主成分鑒定

為充分了解福建產絞股藍的化學成分信息,利用UHPLC-CAD分析福建產絞股藍,得到其CAD指紋圖譜,如圖2a所示,發現色譜峰1～4為福建產絞股藍的主要成分。在相同指紋圖譜液相色譜條件下,利用UHPLC-Q-TOF/MS對福建產絞股藍進行化學成分鑒定,基峰圖如圖2b所示。通過化合物的保留時間、相對分子質量、化學式、質量數誤差、高能量裂解碎片等信息,結合對照品及相關文獻報道即可鑒定出各個色譜峰對應的可能的化合物,鑒定結果見表2。

以色譜峰3和4為例,具體鑒定過程如下。色譜峰3在負離子低能量模式下產生加合離子峰m/z1 007.5 393 [M+HCOO]-和準分子離子峰m/z961.534 9 [M-H]-,推斷其分子式為C48H82O19,同時,其可在負離子高能量模式下產生碎片離子m/z799.483 3、637.431 3和475.379 0,表明結構中含有3分子六碳糖。經與對照品保留時間、相對分子質量等信息對比確定其為絞股藍皂苷XLVI。在負離子模式下色譜峰4產生了兩組碎片離子(見圖3),分別為m/z1 047.534 8 [M4-1-H]-,以及m/z1 077.583 7 [M4-2-H]-和1 123.587 0 [M4-2+HCOO]-的準分子離子峰,推測色譜峰4含有兩個化合物,即化合物4-1和化合物4-2,根據其準分子離子峰,分別推斷化合物4-1的分子式為C51H84O22(m/z1 047.534 8 [M4-1-H]-),化合物4-2的分子式為C53H90O22(m/z1 077.583 7 [M4-2-H]-)。通過提取準分子離子峰,化合物4-1在負離子高能量模式下產生碎片m/z1 003.545 6、961.535 3、799.484 5、637.431 8、475.379 5,表明其在高能量時連續脫去中性特征碎片m/z44(CO2)、m/z42(C2H2O)和3分子六碳糖。除脫去m/z44(CO2)、m/z42(C2H2O)外,其他碎片與對照品絞股藍皂苷XLVI一致,結合文獻[11]報道推斷化合物4-1為丙二?；?絞股藍皂苷XLVI?；衔?-2在負離子高能量模式下產生碎片m/z945.541 4、783.484 9、459.383 7,表明其在高能量時連續脫去1分子五碳糖和3分子六碳糖,結合文獻報道[26]推斷化合物4-2為絞股藍皂苷IV。因此色譜峰4中包含了在此色譜條件下未能實現分離的化合物丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和絞股藍皂苷IV。

表 3 絞股藍皂苷XLVI與LVI的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of gypenoside XLVI and LVI

圖 3 色譜峰4在負離子(a)低能量和(b)高能量模式下的質譜圖Fig. 3 Mass spectra of peak 4 in negative ion (a) low energy and (b) high energy modes

2.2 堿水解條件優化

丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和LVI在福建產絞股藍中含量較大,但其不穩定容易脫去丙二?；?難以得到對照品,故參考人參含量測定文獻中對丙二?；嵝栽碥盏奶幚矸椒╗31],適當進行條件優化后,對絞股藍樣品進行堿水解預處理,再進行含量測定。

分別考察了堿水解中氨水的體積分數(1%、2%和4%)和反應時間(12、24和36 h)對絞股藍皂苷XLVI、絞股藍皂苷LVI、丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和丙二?；?絞股藍皂苷LVI含量的影響。當氨水體積分數為1%和2%時,丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和丙二?；?絞股藍皂苷LVI在36 h內均未能完全轉化,耗時過長;當氨水體積分數為4%時,24 h內丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和LVI即可完全轉化,且36 h與24 h無明顯變化。綜合考慮樣品溶液的pH值以及反應時長,確定堿水解條件:氨水體積分數為4%,反應24 h。判斷堿水解是否完全的過程如圖4所示,分別為該條件下堿水解前、后的UHPLC-CAD色譜圖,色譜峰2已完全轉化,而峰面積相當的色譜峰4沒有完全轉化,由2.1節已知色譜峰4中包含了2個化合物,其中化合物4-2(絞股藍皂苷IV)結構中不含有丙二?；?堿水解對其無影響,結合質譜測定堿水解后該色譜峰m/z1 077.5 837 [M-H]-為化合物4-2,說明含丙二?；幕衔?-1已全部轉化為去丙二?；慕g股藍皂苷XLVI,即該條件下堿水解已完全。

圖 4 絞股藍樣品S10在含4%氨水提取溶劑中反應24 h(a)前、(b)后的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of Gynostemma pentaphyllum sample S10 (a) before and (b) after the reaction in the extraction solvent containing 4% ammonia for 24 h 1. gypenoside LVI; 2. malonylgypenoside LVI; 3. gypenoside XLVI; 4. malonylgypenoside XLVI/gypenoside IV; 4-2. gypenoside IV.

此外,取不同年份、不同來源和不同規格的福建產絞股藍樣品S1、S3、S6和S16在上述條件下進行堿水解,反應后分別取樣品適量,在1.2.2節液相色譜條件下進行UHPLC-CAD分析。如圖5所示,不同批次福建產絞股藍樣品的一致性較好,該堿水解條件下不同含量的丙二?；?絞股藍皂苷XLVI和LVI均能完全轉化為相應的絞股藍皂苷XLVI和LVI,且轉化后絞股藍皂苷XLVI和LVI的總含量遠高于其他皂苷成分,進一步驗證了優化后的堿水解條件的通用性以及質量評價指標成分選擇的合理性。

圖 5 堿水解后不同批次絞股藍樣品的UHPLC-CAD色譜圖Fig. 5 UHPLC-CAD chromatograms of different batches of Gynostemma pentaphyllum sample after the alkali hydrolysis

2.3 提取方法優化

在樣品提取的過程中,分別考察了不同提取溶劑、提取料液比以及提取時間對絞股藍皂苷XLVI和LVI提取率的影響。同時,結合2.2節堿水解條件優化結果,在提取方法優化過程中均在提取溶劑中加入體積分數為4%的氨水。當料液比為1∶150(g∶mL)、超聲提取時間為30 min時,在不同提取溶劑(30%、50%、70%甲醇水溶液和30%、50%、70%乙醇水溶液)下,總提取液中絞股藍皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別為13 378、22 305、24 015、17 670、23 959和21 043,其中,70%甲醇水溶液與50%乙醇水溶液對兩種成分的提取率相當,但由于乙醇更加綠色環保,故選用50%乙醇水溶液(含4%氨水)作為提取溶劑。

當提取溶劑為50%乙醇水溶液(含4%氨水),提取時間為30 min時,在不同料液比(1∶50、1∶100、1∶150和1∶200, g∶mL)下,總提取液中絞股藍皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別是18 152、20 721、23 959和23 974, 1∶150(g∶mL)與1∶200(g∶mL)料液比下,兩種成分的提取率相當,綜合考慮樣品濃度等因素,確定料液比為1∶150(g∶mL)。

此外,當提取溶劑為50%乙醇水溶液(含4%氨水),提取料液比為1∶150(g∶mL),超聲提取時間分別為20、30、40和50 min,總提取液中絞股藍皂苷XLVI和LVI的峰面積之和分別是22 888、23 959、23 917和23 983,當提取時間為30 min時,兩種化合物已被充分提取,再隨著提取時間的增加,峰面積無明顯差異,為縮短分析操作時間,提高分析效率,故選擇提取時間為30 min。

最終提取條件確定為:乙醇-水-氨水(50∶46∶4, v/v/v)作為提取溶劑,料液比1∶150(g∶mL),超聲提取30 min。

2.4 液相色譜條件的優化

考察了不同的色譜柱以及不同的流動相組成對供試品或對照品峰形和分離效果的影響。由于提取溶液中加入了氨水,供試品溶液具有一定的堿性(pH=8.8),故選擇的色譜柱須耐受一定的堿性,選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm; pH耐受范圍:1～12)。

關于流動相的組成,考察了不同的流動相系統(水-甲醇和水-乙腈)對化學成分分離效果的影響,結果顯示在水-乙腈系統下,各待測成分分離效果較好,響應較高,同時,在實驗中發現加入適量的甲酸有助于峰形的改善,因此最終確定流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為乙腈。如圖6所示,該液相色譜條件下供試品中絞股藍皂苷XLVI和LVI保留適中,分離度良好。

圖 6 (a)絞股藍樣品和(b)混合對照品的UHPLC-CAD色譜圖Fig. 6 UHPLC-CAD chromatograms of (a) Gynostemma pentaphyllum sample and (b) mixed reference substances

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系、檢出限和定量限

精密吸取1.3.2節配制的對照品儲備液適量,并將其均勻混合,用50%乙醇逐級稀釋,制得絞股藍皂苷XLVI質量濃度分別為318.00、159.00、79.50、39.75、19.88、9.94 μg/mL,絞股藍皂苷LVI質量濃度分別為409.00、204.50、102.25、51.13、25.56、12.78 μg/mL的系列混合對照品溶液;精密吸取上述系列混合對照品溶液各2 μL,分別按1.3.3節的液相色譜條件進樣測定。CAD是基于霧化-氣溶膠的HPLC檢測器,其響應值與被測物質的量呈指數關系,一般需經對數轉化或用二次函數計算[32]。本文以待測組分質量濃度(μg/mL)的對數值(X)為橫坐標,峰面積的對數值(Y)為縱坐標建立標準曲線。結果如表3所示,絞股藍皂苷XLVI在9.94～318.94 μg/mL、絞股藍皂苷LVI在12.78～409.00 μg/mL范圍內,X與Y線性關系良好,相關系數(r)分別為0.999 3和0.999 5。

分別對2種對照品儲備液逐級稀釋,進樣檢測,分別以信噪比(S/N)等于3和10為標準,確定2種化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),其中,絞股藍皂苷XLVI的檢出限為1.58 μg/mL,定量限為6.36 μg/mL;絞股藍皂苷LVI的檢出限為2.05 μg/mL,定量限為8.18 μg/mL。

2.5.2精密度試驗

取混合對照品溶液,按1.3.3節的液相色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積。絞股藍皂苷XLVI和LVI峰面積的RSD值分別為0.88%和0.44%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.5.3穩定性試驗

取1.3.2節方法制得的同一供試品溶液適量(編號:S10),分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h,按1.3.3節的液相色譜條件進樣檢測,記錄峰面積,計算絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量。二者的RSD值分別為0.98%和0.90%(n=6),表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.4重復性試驗

精密稱取6份同一批次的絞股藍樣品粉末(編號:S10)0.20 g,按1.3.2節方法制備供試品溶液,按1.3.3節的液相色譜條件連續進樣,記錄峰面積,計算絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量。二者RSD值分別為1.39%和1.55%(n=6),表明該方法的重復性良好。

2.5.5加標回收率試驗

精密稱取6份同一批次的絞股藍粉末(編號:S10)0.10 g,精密加入相當量的對照品溶液,按1.3.2節方法制備供試品溶液,按1.3.3節液相色譜條件,連續進樣檢測,記錄峰面積,計算絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量。絞股藍皂苷XLVI與LVI的加標回收率分別在100.2%～107.2%與97.9%～104.2%范圍內,RSD值分別為2.4%與2.6%,表明該方法準確性良好。

2.6 絞股藍樣品含量測定

對包括種植、野生和商品茶在內的16批福建產絞股藍樣品進行含量測定,分別精密稱取樣品粉末0.2 g,按1.3.2節方法制備供試品溶液,按1.3.3節液相色譜條件進樣檢測,分別測定各批次絞股藍樣品中絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量,結果見表4。絞股藍中絞股藍皂苷XLVI的含量在0.57～2.57%之間,絞股藍皂苷LVI的含量在0.66～2.99%之間。其中,野生絞股藍樣品(編號:S1、S2、S6和S10)中指標成分含量略低于種植樣品;商品茶樣品(編號:S14、S15和S16)的指標成分含量高于其他樣品。

表 4 不同批次絞股藍樣品中絞股藍皂苷XLVI和LVI的含量(n=3)Table 4 Contents of gypenoside XLVI and LVI in different batches of Gynostemma pentaphyllum samples (n=3)

3 結論

本研究利用UHPLC-Q-TOF/MS結合UHPLC-CAD鑒定了福建產絞股藍的主要成分,選擇2個含量較高的共有成分絞股藍皂苷XLVI和LVI作為指標成分,利用UHPLC-CAD建立了福建產絞股藍中絞股藍皂苷XLVI和LVI含量的測定方法。該方法靈敏度高,重復性好,可用于福建產絞股藍的質量評價和質量控制,為福建產絞股藍質量標準的建立和完善提供了方法參考。

致謝 感謝安康正大制藥有限公司的李金燦、張軍、師東曉協助采集和搜集絞股藍樣品。