聚乙烯亞胺順鉑高分子偶聯物的制備與表征

賈舟延，賈奕揚，王 偉，宦夢蕾，侯麗爽，周四元，張邦樂

(空軍軍醫大學藥學系藥劑學與藥事管理學教研室，陜西 西安 710032)

順鉑作為重要的抗腫瘤生物烷化劑，對大多數實體腫瘤都有很好的臨床治療效果，其主要是通過進入細胞核與嘌呤堿基發生作用，從而損傷DNA導致腫瘤細胞凋亡[1-2]。但臨床應用發現順鉑的腎、肝和胃腸道毒性較強[3]，因此，化學家和藥學家們對順鉑進行了藥物負載與高分子偶聯相關的新制劑研究工作[4-9]。上述研究在一定程度上提高了順鉑的治療效果并降低了毒副作用，但大多載體對順鉑的載藥率較低[7-9]，導致其臨床應用受限。

聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)，尤其是支化聚乙烯亞胺(branched polyethyleneimine，BPEI)，富含大量的游離伯胺基團，作為載體在基因治療和化學藥物遞送系統構建中發揮著重要的作用[10]。BPEI結構簡單，富含的伯胺基團易于進行化學修飾，如果在BPEI表面偶聯負載藥物，可以很好地實現藥物的負載和有效遞送。

本文在分析順鉑類生物烷化劑應用現狀的基礎上，以BPEI為骨架，利用其富含的大量活潑氨基，將其與葉酸(folic acid，FA)連接在一起，利用FA受體在腫瘤細胞表面的高表達特性[11-13]以實現腫瘤細胞的特異性靶向治療，制備得到具有腫瘤靶向的BPEI順鉑高分子偶聯物(FA-BPEI-SS-Pt)，從而實現順鉑的高負載化和靶向遞送，提高其抗腫瘤效果，為順鉑類抗腫瘤生物烷化劑的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 85-2恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；LABOROTA400旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司)；AL104電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；YE6K792096移液槍(德國Eppendorf 公司)；ZMQS50F01 Milli-Q純水機(法國Milli Pore公司)；KH-300B超聲清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；FD5-series冷凍干燥機(美國GOLD SIM公司)；透析袋(截留Mr 100、1 000和7 000)(西安科昊生物工程有限公司)；Thermofisher X2電感耦合等離子體質譜儀(美國Thermofisher X2公司)；FTIR-8400S紅外光譜測量儀(瑞士萬通公司)；AC200核磁共振儀(美國Varian公司)；BIO-RAD酶聯免疫檢測儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)；BSC-1300ⅡA2生物安全柜(北京科偉永興儀器有限公司)；BIOFIL 96孔板(廣州杰特生物有限公司)。

1.1.2 實驗試劑 998 g/L順鉑、998 g/L硝酸銀、990 g/L胱胺二鹽酸鹽購自上海薩恩化學技術有限公司；990 g/L FA購自上海安耐吉化學公司；990 mL/L三乙胺購自廣東光華科技股份有限公司；990 g/L丁二酸酐購自上海國藥集團化學試劑有限公司；995 mL/L 1,4-二氧六環購自天津市福晨化學試劑廠；990 g/L BPEI購自美國Sigma-Aldrich公司；990 g/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、995 g/L N-羥基琥珀酰亞胺購自上海麥克林生化科技有限公司；998 mL/L甲醇購自天津高宇精細化工有限公司；995 g/L N,N′-羰基二咪唑購自美國Sun Chemical公司；2.5 g/L EDTA- 胰蛋白酶、青鏈霉素溶液(100X)購自北京索來寶生物科技有限公司；RPMI 1640培養基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自上海依科賽生物科技有限公司；PBS粉末、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自西安科昊生物工程有限公司。

1.1.3 實驗細胞 人非小細胞肺癌細胞系A549由中國科學院細胞庫提供。

1.2 方法

1.2.1 順鉑配合物的合成 水化順鉑的合成參照文獻[14]的方法進行。將675 mg(2.23 mmol)順鉑加入225 mL Ⅲ級凈化的超純水中，在37 ℃避光條件下攪拌至完全溶解，然后冷卻至室溫。再加入758 mg(4.45 mmol)硝酸銀，于室溫下繼續避光攪拌48 h，5 000 r/min離心30 min，重復2次后，用水系濾器(0.1 μm)對上述所得上清液進行過濾，制備得到水化順鉑溶液，避光保存備用。

在室溫條件下，將499 mg(2.18 mmol)胱胺二鹽酸鹽溶解于25 mL甲醇中。冰浴冷卻后，向上述溶液中加入446 mg(4.36 mmol)三乙胺并攪拌30 min。稱取丁二酸酐202 mg(1.98 mmol)溶解于37 mL無水1,4-二氧六環中，將其慢慢滴入胱胺-甲醇溶液中，滴加時間30 min。滴加完畢后升溫至室溫，繼續攪拌1.5 h。將反應液在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾。除去有機溶劑后，加入77 mL 3 mg/L的Na2CO3溶液。用50 mL乙醚洗滌3次，收集水相，旋轉蒸發除去殘留的乙醚，得到丁二酸-胱胺連接物水溶液[15]。

將上述所得丁二酸-胱胺連接物水溶液于室溫下緩慢滴加到200 mL的水化順鉑水溶液中，隔絕氧氣條件下避光反應，48 h后將反應液減壓濃縮到約10 mL后，移至透析袋中(截留Mr 100)，用2 000 mL 超純水透析3次，每2 h 換水1次，透析完成后冷凍干燥，得黃色粉末狀順鉑配合物583 mg，收率為61.2%，熔點31 ℃。

1.2.2 FA修飾BPEI的合成 將100 mg(0.45 mmol)FA溶解于10 mL DMSO中，加入130 mg(0.68 mmol)1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和73 mg(0.68 mmol)N-羥基琥珀酰亞胺，于室溫下攪拌4 h。500 mg BPEI溶于10 mL的DMSO中。將FA溶液緩慢滴入BPEI溶液中，滴加10 min，室溫攪拌繼續反應20 h。反應結束后，將其轉移至透析袋(截留Mr 1 000)中，于2 000 mL 0.1 mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉(1∶1)溶液中透析8次，每6 h換水1次。然后將其轉移至2 000 mL純水中，每6 h換水1次，在同樣條件下透析4次。透析完成后冷凍干燥，得FA修飾的BPEI 432 mg，收率為72.1%。

1.2.3 FA-BPEI-SS-Pt的合成 將58 mg FA修飾的BPEI加入5 mL的60 ℃超純水中，超聲條件下使其完全溶解。稱取85 mg(157 μmol)順鉑配合物加入10 mL的超純水中，室溫攪拌溶解，制得順鉑配合物水溶液，將其冰浴冷卻后加入28 mg(174 μmol)羰基二咪唑，攪拌1 h后移去冰浴，升溫至室溫后，加入FA修飾的BPEI水溶液，于避光條件下繼續室溫攪拌24 h。將上述反應混合液轉移至透析袋(截留Mr 7 000)中，用2 000 mL的超純水透析4次，間隔2 h換水1次。透析后冷凍干燥，得FA-BPEI-SS-Pt 101 mg，收率為78.1%。

1.2.4 FA-BPEI-SS-Pt的靶向性研究 使用含有2 g/L FA的RPMI 1640培養液將A549細胞提前孵育2 h后，加入鉑(Pt)濃度分別為0、1、4、16 mg/L的FA-BPEI-SS-Pt，以未加入2 g/L FA的RPMI 1640培養液作為對照組。再加入含100 mL/L血清的RPMI 1640細胞培養基使每孔體積至200 μL，繼續孵育48 h。孵育結束后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液(PBS配制)，孵育4 h后終止培養，吸除孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，測定每孔A492 nm值，并計算細胞存活率：細胞存活率=[(實驗組A492 nm值-溶媒背底A492 nm值)/(空白對照組A492 nm值-溶媒背底A492 nm值)]×100%。

1.2.5 FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤活性評價 采用MTT法測定FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤活性。取對數生長期的A549細胞，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基配置成5×104個/mL的細胞懸液，取200 μL細胞液接種于96孔板。在37 ℃， 50 mL/L CO2的培養箱中孵育24 h 后，將FA-BPEI-SS-Pt和BPEI-SS-Pt均按照Pt濃度分別為0、1、2、4、8、16 mg/L進行給藥，并設置復孔。用RPMI 1640培養液進行逐級稀釋，每孔100 μL。給藥完成后，再加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基100 μL，對照組加入200 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養基，孵箱中孵育48 h。孵育結束后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液(PBS配制)，孵育4 h后終止培養，吸除孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，測定每孔A492 nm值，并計算細胞存活率：細胞存活率=[(實驗組A492 nm值-溶媒背底A492 nm值)/(空白對照組A492 nm值-溶媒背底A492 nm值)]×100%。

1.2.6 統計學分析 所有統計數據以ˉx±s表示，各組實驗數據通過GraphPad Prism 9.0軟件進行相關統計分析，各組間指標比較采用多組間單因素方差分析，當組間比較有統計學差異時，采用LSD-t檢驗對特定的兩組之間進行檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑配合物的合成與表征

在將丁二酸-胱胺連接物水溶液緩慢滴加到水化順鉑溶液中時，要注意避光隔絕空氣來防止Pt2+的氧化，并且要用滴液漏斗緩慢地滴加，滴加時間應不少于30 min。順鉑配合物的紅外吸收光譜(infrared absorption spectrum，IR)和核磁共振氫譜(hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H NMR)具體解析結果如下：IR(KBr壓片)的波長為3 387、2 943、1 636、1 543、1 396、1 049、636 cm-1；1H NMR (D2O，400 MHz，ppm)的化學位移為3.52(t，2H，J=6.4 Hz)，3.23～3.17(m，2H)，2.85(t，2H，J=6.4 Hz)，2.48～2.46(m，6H)。

經IR和1H NMR鑒定，所得產物與目標物的化學結構一致，可用于后續的合成反應。

2.2 FA修飾BPEI的合成與表征

在實驗過程中，活化FA的羧基基團時，選用DMSO為溶劑使FA充分溶解與活化。FA與BPEI反應后將所得產物純化時，采用碳酸鈉-碳酸氫鈉(1∶1)混合溶液為透析液使FA成鹽，增加其水溶性并充分透析，保證了未反應FA的去除。IR和1H NMR的具體解析結果如下：IR(KBr壓片)的波長為3 292、2 941、2 825、1 652、1 506、1 471、1 299、1 103、814、768 cm-1；1H NMR(DMSO-D6，400 MHz，ppm)的化學位移為8.64(s，1H)，8.00(s，2H)，6.66(s，2H)，5.33(s，1H)，3.52～3.38(m，378H)，2.34(m，2H)，2.15～1.97(m，4H)；元素分析為C 46.72%，H 8.72%，N 22.90%。

經IR和1H NMR鑒定，FA連接于BPEI高分子材料上。由元素分析測定結果可知，FA修飾BPEI中FA的接枝率(m/m)為0.096。

2.3 FA-BPEI-SS-Pt的合成與表征

FA-BPEI-SS-Pt的IR和1H NMR具體解析結果如下：IR(KBr壓片)的波長為3 271、2 835、2 827、1 645、1 606、1 506、1 472、1 394、1 045、814、766 cm-1；1H NMR(CDCl3，400 MHz，ppm)的化學位移為8.40(s，1H)，8.15(s，2H)，7.64(s，2H)，6.68(s，1H)，3.50～3.31(m，404H)，3.23～3.17(m，26H)，2.74(t，26H，J=6.0 Hz)，2.38～2.29(m，78H)，2.24(m，2H)，2.15～2.12(m，4H)；元素分析為C 32.51%，H 6.43%，N 14.37%。

經IR和1H NMR鑒定，順鉑配合物與FA修飾BPEI連接成功，形成FA-BPEI-SS-Pt。FA-BPEI-SS-Pt中順鉑的負載量通過電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)進行測定，所建立Pt的ICP-MS標準曲線為y=0.978x+1.508 9(R2=0.998 9)，FA-BPEI-SS-Pt中負載順鉑的量為(34.66±0.11)%，遠高于文獻[4,7-9]報道的6.67%～15.21%，實現了順鉑的高負載化。

2.4 FA-BPEI-SS-Pt的靶向性研究

為進一步驗證FA基團的引入對順鉑抗腫瘤活性的影響，采用加入FA的競爭性實驗對其腫瘤靶向性進行了研究。實驗結果(圖1)表明，加入FA(孵育濃度為2 g/L)競爭腫瘤細胞表面FA受體時，并不會對細胞生長產生抑制或促進作用(Pt濃度為 0 mg/L)，所選FA濃度不影響實驗結果的判定。相比于未加入FA提前孵育組，Pt濃度為1、4、16 mg/L的各濃度組中加入FA提前孵育時的細胞存活率均增高，抗腫瘤活性明顯減弱，這與加入底物FA后可抑制腫瘤細胞表面FA受體介導的入胞[11-13]、競爭性減弱FA-BPEI-SS-Pt的靶向作用、對腫瘤細胞的殺傷作用降低有關。

FA-BPEI-SS-Pt：FA修飾順鉑高分子偶聯物組；FA-BPEI-SS-Pt+FA：加入FA提前孵育的FA修飾順鉑高分子偶聯物組。FA：葉酸；BPEI：支化聚乙烯亞胺。 vs FA-BPEI-SS-Pt。圖1 加入FA對FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤活性的影響

2.5 FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤活性評價

采用MTT法在A549細胞上對FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤活性進行評價。溶媒以及BPEI-SS-Pt作為對照。研究結果表明，BPEI-SS-Pt和FA-BPEI-SS-Pt均具有較好的抗腫瘤活性，隨著Pt濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，呈明顯的劑量依賴關系(圖2)。經Graphpad Prism 9.0軟件計算得出，BPEI-SS-Pt的IC50值為3.12 mg/L，FA-BPEI-SS-Pt的IC50值為2.91 mg/L。由于FA靶向基團的引入， FA-BPEI-SS-Pt的抗腫瘤作用增強，測試劑量下效果均優于BPEI-SS-Pt(P<0.01)。

Control：不加藥物組；BPEI-SS-Pt：順鉑高分子偶聯物組；FA-BPEI-SS-Pt：FA修飾的順鉑高分子偶聯物組。FA：葉酸；BPEI：支化聚乙烯亞胺。圖2 BPEI-SS-Pt和FA-BPEI-SS-Pt抗腫瘤活性測定結果

3 討論

本文以順鉑、BPEI和FA為原料，設計合成得到以FA為腫瘤靶向基團的基于BPEI的FA-BPEI-SS-Pt。所設計路線操作簡便，反應條件溫和，制備得到的產物及其中間體的結構經IR、1H NMR和元素分析等鑒定，與所設計的目標分子結構一致。進一步研究表明，富含大量活潑氨基BPEI骨架材料的應用和FA腫瘤靶向基團的引入實現了順鉑的高負載化和FA介導的靶向遞送，提高了其抗腫瘤效果，為順鉑類抗腫瘤生物烷化劑的新制劑研發奠定了基礎。