基于BDNF/TrkB/CREB 途徑探討缺氧缺血性新生幼鼠海馬神經元凋亡及腦發育損傷的機制研究

盧田甜，張 耀，梁 彬，劉 敏，陳秀靈，賈雁平

（1.?？谑袐D幼保健院新生兒科，海南 ?？?570203；2.?？谑腥嗣襻t院兒科，海南 ?？?570208）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic ischemic brain injury，HIBI）是造成新生兒永久性神經系統損傷和死亡的主要原因之一［1］。研究顯示：0.1%～0.2% 的新生兒出現由于圍生期窒息引起的HIBI，死亡率高達20%，而40%的幸存者出現智力障礙、腦癱、癲癇等嚴重并發癥［2］。目前研究報道的HIBI 發生可能與炎癥反應、氧化應激、能量耗竭、鈣離子超載等多種病理生理機制相關，但仍未有統一的定論。腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是一種神經營養因子，酪氨酸蛋白激酶B（TrKB）是BDNF 的特異功能受體，二者相互結合具有促進HIBI 后腦組織的修復及再生的作用［3］。環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）可以誘導BDNF 的基因轉錄進而調節其表達，與HIBI 后神經元的再生、修復等生理過程［4］?；诖?，本研究以HIBI 幼鼠為研究對象，以BDNF/TrkB/CREB 通路為作用靶點，探索其在HIBI 發病中的作用，為臨床防治HIBI提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生7 日齡Wistar 幼鼠95 只，體重（13.6 ±1.7）g，雌雄各半，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK（鄂）2018-0005。本研究所使用的實驗動物均遵守海南醫學院倫理委員會標準，在實驗過程中盡可能使動物在舒適的環境中完成，手術麻醉、給藥時嚴格規范操作以減輕實驗動物的痛苦，實驗結束后動物采用安樂死的手段處死，并委托學校動物管理中心處理所有動物尸體。

1.2 試劑

原位末端轉移酶標記（TUNEL）檢測試劑盒（美 國Roche 公 司）；2，3，5-氯 化 三 苯 基 四 氮 唑（TTC）試劑盒（美國Sigma 公司）；BDNF、TrkB、CREB 慢病毒載體及空載體（上海吉凱基因化學技術有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑（美國Thermo 公司）；BDNF、TrkB、CREB、β-actin抗體（美國Proteintech 公司）。

1.3 HIBI 模型制備

參照Rice-Vannucci 經典方法復制新生幼鼠HIBI 模型［5］。幼鼠乙醚吸入麻醉，消毒后固定于手術臺，分離左側頸總動脈，結扎兩端，中間剪斷，縫合皮膚，放入裝有母鼠糞便的墊料中2 h，然后置于含92% N2+ 8% O2混合氣體的有機玻璃箱缺氧處理2 h，記錄幼鼠一般行為。幼鼠出現自發向左轉圈或夾尾尖叫證明模型復制成功，將幼鼠重新放回籠中母乳喂養。假手術組僅分離左側頸總動脈，不進行結扎和缺氧，縫合后放回籠中母乳飼養。

1.4 實驗分組

取10 只假手術組幼鼠作為對照1 組，另外取10只HIBI 模型幼鼠，檢測幼鼠學習記憶能力、腦組織損傷及海馬組織中BDNF、TrkB、CREB 蛋白的表達。取15 只假手術組幼鼠作為對照2 組，另外取60只HIBI 模型幼鼠分為陰性對照（NC）組、BDNF 過表達（LV-BDNF）組、TrkB 過表達（LV-TrkB）組、CREB 過 表 達（LV-CREB）組，每 組 15 只。LV-BDNF 組、LV-TrkB 組、LV-CREB 組分別 通過尾靜脈注射滴度為1.7×109TU/mL 的BDNF 慢病毒 載 體5×107TU，滴 度 為2.1×109TU/mL 的TrkB 慢病毒載體1×107TU，滴度為1.4×109TU/mL）的CREB 慢病毒載體5×106TU，NC 組尾靜脈注射滴度為2×109TU/mL 的空慢病毒載體1×106TU；每4 周1 次，連續2 次，8 周后結束實驗。檢測幼鼠學習記憶能力、腦組織損傷、海馬神經元凋亡情況及Bcl-2、Bax、NF-κB 蛋白表達。

1.5 Y-迷宮測試記憶力和學習能力

Y-迷宮是一個底部可以通電的三等臂式反射箱，每臂端有一個信號燈，燈亮時為此臂安全未通電，另兩臂通電（電壓為50～70 V，強度為能使小鼠產生逃避行為）。實驗時隨機變更安全區，電擊幼鼠后以其立即逃避到安全區為一次正確反應，連續9 次正確反應為學會，每次電擊持續5 s。記錄幼鼠學會所進行的訓練次數，次數越少表示學習能力越好［6］。電擊實驗結束24 h 后檢測記憶力，總共進行20 次，記憶能力為正確反應次數占總檢測次數的百分比。

1.6 TTC 染色法測定腦梗死體積

每組隨機取5 只幼鼠，斷頭處死，取出腦組織，置于0.15 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液，4 ℃冷凍5 min，間隔2 mm 冠狀切片，切片浸入5 mL 含1% 的TTC 磷酸鹽緩沖液，37 ℃避光孵育0.5 h，TTC 染色后，紅色表示正常腦組織，白色表示梗死組織，取出腦片，放入10% 福爾馬林中固定，逐層拍照，用Imagepro Plus 圖像分析軟件處理并統計，計算每層梗死面積，乘以層面為腦梗死體積。

1.7 TUNEL 檢測海馬區神經元凋亡水平

每組隨機取5 只幼鼠斷頭處死，無菌條件分離海馬組織，4% 多聚甲醛固定，乙醇脫水，常規石蠟包埋，冠狀切片，厚3～5 μm，烤片、脫蠟、乙醇水合，蛋白酶k 消化30 min，PBS 洗滌3 次，加入TUNEL反應液，置于37 ℃暗溫盒60 min，蘇木素復染、乙醇脫水、二甲苯透明封片。每張切片選取5 個不重復視野，計數TUNEL 陽性神經元，取平均值。

1.8 Western blot 檢測幼鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB、Bcl-2、Bax 及NF-κB 蛋白的表達

每組隨機取5 只幼鼠幼仔斷頭處死，低溫下取幼鼠左側海馬組織，加入RIPA 充分裂解，12 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，用BCA 法測定上清液中蛋白含量，取40 μg 蛋白，加入緩沖液變性，電泳、轉膜、封閉、加入一抗BDNF、TrkB、CREB、Bcl-2、Bax、NF-κB、β-actin，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗滌，用ECL化學發光試劑顯色后，化學發光儀成像。

1.9 統計學處理

數據統計分析采用SPSS 17.0 軟件包，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后幼鼠學習記憶能力變化

與對照1 組幼鼠比較，HIBI 組幼鼠學習能力及記憶力測試正確反應率明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 造模后幼鼠學習能力及記憶力測試正確反應率（%，n=10，±s）Tab 1 Correct response rate of learning ability and memory test in young rats after modeling（%，n=10，±s）

表1 造模后幼鼠學習能力及記憶力測試正確反應率（%，n=10，±s）Tab 1 Correct response rate of learning ability and memory test in young rats after modeling（%，n=10，±s）

注：與對照1 組比較，#P＜0.01。

組別對照1 組HIBI 組記憶能力68.00±7.02 27.33±5.30#7.638 0.004 tP學習能力71.52±8.01 29.66±1.66#9.126 0.000 6

2.2 造模后幼鼠腦組織損傷

與對照1 組比較，HIBI 組幼鼠腦組織梗死體積明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 造模后幼鼠腦組織梗死體積（n=5，±s）Tab 2 Infarct volume of brain tissue in young rats after modeling（n=5，±s）

表2 造模后幼鼠腦組織梗死體積（n=5，±s）Tab 2 Infarct volume of brain tissue in young rats after modeling（n=5，±s）

注：與對照1 組比較，#P＜0.01。

腦組織梗死體積（mm3）0.59±0.03 6.64±0.59#11.719 0.0001組別對照1 組HIBI 組tP

2.3 造模后幼鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB 蛋白表達

與對照1 組幼鼠比較，HIBI 組幼鼠海馬組織中BDNF、TrkB 明顯升高，CREB 表達明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 造模后幼鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB 蛋白表達（n=5，±s）Tab 3 Expression of BDNF，TrkB and CREB proteins in the hippocampus of young rats after modeling（n=5，±s）

表3 造模后幼鼠海馬組織BDNF、TrkB、CREB 蛋白表達（n=5，±s）Tab 3 Expression of BDNF，TrkB and CREB proteins in the hippocampus of young rats after modeling（n=5，±s）

注：與對照1 組比較，#P＜0.01。

組別對照1 組HIBI 組CREB 0.81±0.03 0.38±0.04#8.824 0.002 tP BDNF 0.63±0.03 0.88±0.05#6.682 0.006 TrkB 0.52±0.02 0.78±0.06#5.467 0.004

2.4 調節BDNF、TrkB、CREB 表達對幼鼠學習記

憶能力的影響

與對照2 組比較，NC 組幼鼠學習及記憶力測試正確反應率明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與NC 組幼鼠比較，LV-BDNF 組、LV-TrkB組、LV-CREB 組幼鼠學習及記憶力測試正確反應率明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠學習能力及記憶力測試正確反應率（%，n=15，±s）Tab 4 Learning ability and correct response rate of memory test in young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（%，n=15，±s）

表4 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠學習能力及記憶力測試正確反應率（%，n=15，±s）Tab 4 Learning ability and correct response rate of memory test in young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（%，n=15，±s）

注：與對照2 組比較，#P＜0.01；與NC 組比較，*P＜0.01。

記憶力69.67±6.40 28.33±4.88#57.33±6.78*48.67±7.43*54.33±6.23*9.987 0.002組別對照2 組NC 組LV-BDNF 組LV-TrkB 組LV-CREB 組FP學習能力73.23±7.31 33.01±3.48#62.35±5.29*49.95±4.09*57.44±3.85*11.256 0.0004

2.5 調節BDNF、TrkB、CREB 表達對幼鼠腦組織損傷的影響

與對照2 組比較，NC 組幼鼠腦組織梗死體積顯明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與NC組幼鼠比較，LV-BDNF 組、LV-TrkB 組、LV-CREB組幼鼠腦組織梗死體積明顯減小，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表5。

表5 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠腦組織梗死體積（n=5，±s）Tab 5 Infarct volume in young rat brain tissue after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

表5 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠腦組織梗死體積（n=5，±s）Tab 5 Infarct volume in young rat brain tissue after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

注：與對照2 組比較，#P＜0.01；與NC 組比較，*P＜0.01。

腦組織梗死體積（mm3）0.55±0.03 6.68±0.59#1.14±0.15*1.62±0.13*1.24±0.22*13.156 0.003組別對照2 組NC 組LV-BDNF 組LV-TrkB 組LV-CREB 組FP

2.6 調節BDNF、TrkB、CREB 表達對幼鼠海馬神經元凋亡的影響

與對照2 組比較，NC 組幼鼠海馬區TUNEL 陽性細胞數明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與NC 組幼鼠比較，LV-BDNF 組、LV-TrkB組、LV-CREB 組幼鼠海馬區TUNEL 陽性細胞數明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表6和圖1。

表6 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠海馬組織神經元凋亡情況（個，n=5，±s）Tab 6 The apoptosis of hippocampal neurons in young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

表6 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠海馬組織神經元凋亡情況（個，n=5，±s）Tab 6 The apoptosis of hippocampal neurons in young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

注：與對照2 組比較，#P＜0.01；與NC 組比較，*P＜0.01。

TUNEL 陽性細胞數2.40±0.55 116.40±10.57#47.60±5.22*58.80±5.76*51.40±3.05*14.965 0.0008組別對照2 組NC 組LV-BDNF 組LV-TrkB 組LV-CREB 組FP

圖1 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠海馬組織神經元凋亡情況（×100）Fig 1 The apoptosis of hippocampal neurons in young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（×100）

2.7 調節BDNF、TrkB、CREB 表達對幼鼠海馬組織Bcl-2、Bax 及NF-κB 蛋白表達的影響

與對照2 組比較，NC 組幼鼠海馬組織中促凋亡蛋白Bax、NF-κB 蛋白表達明顯增強（P＜0.05），而抑凋亡蛋白Bcl-2 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。與NC 組 比 較，LV-BDNF 組、LV-TrkB 組、LV-CREB組幼鼠海馬組織中Bax、NF-κB 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達明顯增強（P＜0.05）。見表7。

表7 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠海馬組織Bcl-2、Bax及NF-κB 蛋白表達（n=5，±s）Tab 7 Bcl-2，Bax and NF-κB protein expression in hippocampal tissue of young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

表7 調節BDNF、TrkB、CREB 表達后幼鼠海馬組織Bcl-2、Bax及NF-κB 蛋白表達（n=5，±s）Tab 7 Bcl-2，Bax and NF-κB protein expression in hippocampal tissue of young rats after regulation of BDNF，TrkB and CREB expression（n=5，±s）

注：與對照2 組比較，#P＜0.01；與NC 組比較，*P＜0.01。

組別對照2 組NC 組LV-BDNF 組LV-TrkB 組LV-CREB 組NF-κB 0.91±0.06 2.21±0.11#1.44±0.08*1.36±0.06*1.25±0.07*15.015 0.0002 FP Bcl-2 0.85±0.05 0.25±0.05#0.59±0.05*0.69±0.06*0.61±0.04*9.987 0.005 Bax 0.69±0.04 1.67±0.09#0.95±0.06*0.85±0.08*0.82±0.06*12.365 0.0007

3 討論

大鼠出生時的生理組織狀態相當于人類新生兒的早產階段，但其出生后腦組織的發育速度比人類新生兒快很多，7 日齡大鼠細胞增殖分化程度和腦室周圍生發基質情況基本與新生兒相當。目前缺血缺氧腦損傷模型的制備方法最經典的即為Rice 改良方法，其操作簡單且成功率較高，時間和癥狀程度易掌握且組織病理改變明顯，因此，本實驗選擇7 日齡幼鼠，采用Rice 改良法復制新生幼鼠HIBI 模型。海馬是HIBI 模型對損傷最敏感的部位，研究顯示，缺血缺氧可造成新生幼鼠海馬區神經元的大量凋亡［7，8］。經過TTC 染色發現模型組幼鼠大腦皮層、海馬等區域有大片明顯的白色梗死區域，梗死體積明顯增加，提示實驗模型復制成功。有研究報道，HIBI 對幼鼠海馬區影響較大的是CA1 區的機體認知和神經元功能［9，10］。本研究結果發現HIBI 幼鼠學習能力、記憶能力明顯減弱，與文獻報道一致。綜上可知，HIBI 可以誘導新生幼鼠海馬組織神經元凋亡，進而促使大鼠學習、記憶能力下降。

BDNF 屬神經營養因子家族成員，廣泛存在于腦組織，在海馬區含量較多，可促進神經元生殖、發育、分化、再生，增強中樞神經的營養支持、保護及功能的表達［11］，在缺血缺氧應激刺激下，高表達的BDNF 具有保護神經元的作用。有研究顯示：對HIBI 新生大鼠側腦室注射BDNF 可以明顯抑制海馬CA1 區 神經元死亡［12］。TrkB 是BDNF 的特異性受體，可以傳遞信號，反應性引起細胞內各信號通路的活化，促進神經細胞的發育、損傷后的修復以及再生［13］。當HIBI 發生后，BDNF、TrkB 蛋白在受損區高度表達，二者大量結合可以促使CREB 的活化，維持神經細胞存活并促進其修復［14，15］。李亞琴等［16］研究顯示，HIBI 小鼠過表達BDNF 后，腦組織中TrkBmRNA 和蛋白表達增強，加強神經細胞的修復作用。CREB 是一種重要的轉錄因子核蛋白，能夠通過Ca2+途徑、調控一些營養因子表達等調節BDNF 的表達，抑制神經元凋亡等［17］。本研究發現，模型組幼鼠海馬區CREB 蛋白表達明顯降低，BDNF、TrkB 蛋白表達明顯升高。為進一步探討其發生機制，本研究采用尾靜脈注射BDNF、TrkB、CREB 慢病毒載體的方法對幼鼠進行干預，結果顯示，過表達BDNF、TrkB、CREB 后，幼鼠學習能力、記憶能力明顯增強，腦組織梗死體積明顯縮小，TUNEL 陽性細胞數明顯減少，說明幼鼠神經元功能、機體認知功能得到改善。

Bcl-2 是一種重要的抗凋亡基因，研究證實，Bcl-2 表達下調會導致細胞凋亡［18，19］。Rousset 等［20］研究發現，缺血缺氧可以促進Bax 從抗凋亡因子復合體中釋放出來，從而進入線粒體激活細胞凋亡的發。NF-κB 是細胞信號轉導過程中一個重要的免疫應答因子，參與調控細胞免疫應答、細胞增殖、細胞凋亡等多種細胞應激行為，NF-κB 可以通過調控抗凋亡因子、凋亡誘導配體等的表達或信號傳遞，促進細胞凋亡的發生。研究發現，新生大鼠缺血缺氧后，腦部NF-κB 表達量將會上調，抑制NF-κB 可以有效降低HIBI 大鼠神經元凋亡水平［21］。本研究檢測幼鼠海馬組織中Bcl-2、Bax 及NF-κB 蛋白表達，結果發現模型組幼鼠Bax、NF-κB 蛋白表達明顯升高，Bcl-2 蛋白表達明顯降低，說明HIBI 能引起海馬組織神經細胞凋亡的發生，與文獻報道一致；而過表達BDNF、TrkB、CREB 組幼鼠Bax、NF-κB 蛋白表達明顯降低，Bcl-2 蛋白表達明顯升高，表明調節BDNF、TrkB、CREB 表達可能是通過調節凋亡蛋白等表達抑制神經細胞的凋亡，改善模型幼鼠腦組織損傷病變的。

綜上所述，HIBI 模型幼鼠存在BDNF、TrkB、CREB 表達異常，過表達BDNF、TrkB、CREB 可以改善幼鼠學習記憶能力，修復腦組織損傷，抑制海馬區細胞凋亡，因此，HIBI 的發生機制可能與BDNF、TrkB、CREB 途徑有關。

作者貢獻度說明：

盧田甜：實驗設計、實驗操作、指標檢測，撰寫論文；張耀、梁彬：協助實驗造模、指標檢測；劉敏、陳秀靈：收集數據，統計分析；賈雁平：實驗指導、論文修改、審閱。

本文所有作者聲明無任何利益沖突。