基于UPLC-Q/TOF-MS技術的東北黃精、多花黃精及滇黃精成分分析

楊波，黃金月，鄭時嘉，唐檬，馬鷹，夏念桐，于純淼，王志剛*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農業綜合開發股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150300)

黃精(Polygonatirhizoma)收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，為百合科黃精(Polygonatumsibiricum)、多花黃精(Polygonatumcyrtonema)及滇黃精(Polygonatumkingianum)的干燥根莖[1]，兼具藥用、食療、外敷[2]、觀賞[3]等功效價值，收載于最新版《按照傳統既是食品又是中藥材的物質目錄》中[4]。黃精多糖、皂苷、蒽醌、黃酮及氨基酸等多種有效成分，具有補氣、養陰、止饑、除風濕、耐寒暑、抗衰老、抗炎抗菌、增強免疫力等活性[5-6]，可用于預防或治療阿爾茲海默病、糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化等病癥[7-8]。黃精亦是傳統中藥材，分布于關藥、北藥、南藥、云藥及貴藥，其中關藥指東北地區，主要分布于黑龍江、吉林、內蒙古；北藥指華北地區，主要分布于山西、河北，盛產黃精；南藥指長江以南，南嶺以北地區，主要分布于江西、湖南，盛產多花黃精；云藥指云南省，貴藥指貴州省，盛產滇黃精[9]。隨著黃精繁殖培育勢頭正盛，黃精保健茶、沖調食品和即食食品等保健品系列也紛紛興起，各產地黃精質量良莠不齊，黃精的化學成分分析及相應的質量控制方法制訂至關重要。

黃精中所含化學成分是衡量各產地黃精質量標準的重要指標，目前關于各產地黃精成分分析的研究主要有高效液相檢測、液質聯用、氣質聯用等，但針對藥典中3種基源黃精的全成分分析卻未見報道[10]。超高效液相色譜與四極桿飛行時間質譜聯用(UPLC-Q/TOF-MS)因靈敏度高、檢測速度快等絕對優勢，成為近年來復雜基質全成分分析的最有效方法之一。本研究以超聲波輔助提取法對黃精干燥根莖進行樣品前處理，以UPLC-Q/TOF-MS對黃精、多花黃精及滇黃精進行全成分分析，為進一步制訂黃精質量標準、促進黃精資源開發和藥食兩用提供參考[11]。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜(Waters AcquityTM UPLC)-質譜(Waters SynaptTMG2-Si MS)聯用儀(美國沃特世科技有限公司)；Masslynx V4.1工作站(美國沃特世科技有限公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Thermo Scientific Finnpipette F3單通道移液器(規格20～200 μL,美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試劑和藥材

分析純甲醇(天津市富宇精細化工有限公司)；色譜級乙腈(德國Merck技術有限公司)；亮氨酸腦啡肽(美國SIGMA技術有限公司)；黃精生藥材(批號：20210813，天問山農業綜合開發股份有限公司)；多花黃精生藥材(批號：20210811，湖南天地農業發展有限公司)；滇黃精生藥材(批號：20210723，四川福曦堂生物科技有限公司)。黃精生藥材經黑龍江中醫藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定為黃精、多花黃精及滇黃精。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

黃精根莖除須根，洗凈，切片，置60 ℃烘箱中干燥[12]。取干燥后的黃精切小塊，粉碎，過4號(60目)篩，稱取粉末2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇[13]20 mL，稱重，超聲提取40 min，提取2次，放冷至室溫，稱重，補足失重80%甲醇，過濾，合并2次濾液，蒸干，浸膏用少量甲醇復溶[14]，并轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻線，置4 ℃冰箱中冷藏備用。臨用前，過0.22 μm微孔濾膜至進樣杯中，供UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3(1.8 μm 2.1 mm×100 mm Column)；流動相 A：0.1%甲酸-乙腈，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脫(0～5 min，10%～25%A；5～10 min，25%～50%A；10～20 min，50%～85%A；20～30 min，85%～100%A)；色譜柱溫度：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL[15]。

2.2.2 質譜條件

采用全掃描和全信息串聯質譜(MSE)模式掃描，電噴霧(ESI)離子源，以centriod模式分別在正、負離子模式下采集數據，并采用美國Waters集團公司獨家專利Lockspray校正系統進行在線亮氨酸-腦啡肽(Leueine-enkephalin，[M+H]+=556.277 1；[M-H]-=554.277 1)質量校正，溶液濃度為1 ng/μL，流速為10 μL/min，掃描范圍：50～1200 Da。本實驗中正、負離子模式下的質譜具體參數設置值：錐孔電壓40 v；毛細管電壓3 kv；離子源溫度210 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；錐孔氣體流量50 L/h。

2.3 供試品溶液的UPLC-Q/TOF-MS分析

取“2.1”項下供試液，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測。

2.4 數據收集與處理

MSE數據首先通過MassLynx V4.1工作站進行色譜峰的初步提取和預處理，然后利用MassLynx中的“Elemental Composition”工具獲取質譜信息，并查詢Chemspider、Pubchem、TCMSP、HMDB、KEGG、MassBank等數據庫。在此僅以PubChem數據庫舉例說明，通過MassLynx V4.1工作站獲取初步的分子式、分子質量、誤差(ppm)和碎片離子等質譜信息，選擇ppm值最小的分子式，進入Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過比對二級質譜碎片離子相關信息選取最符合的化合物。再結合 PubMed、CNKI等網站，參考中英文相關文獻，建立黃精化合物數據庫，再次根據碎片離子信息與數據庫進行比對，進行化學成分的初步鑒定。

3 結果與分析

3.1 UPLC色譜分析

黃精藥材中成分種類眾多，若提取方法或試劑選取不恰當，可能會造成某類成分嚴重缺失。目前提取方法多為超聲波提取法、水浴回流法，水提取等，經前期驗證，水提取法提取成分較單一，多為多糖類，且水溶液易霉變不易保存；水浴回流法費時費力，最終確定以超聲提取法作為供試品溶液制備方法。提取溶劑多為乙醇、甲醇等，經查閱文獻，乙醇提取主要成分為皂苷、黃酮類，不具有全面性。本研究用甲醇作為提取溶劑，結合超聲波法對3種黃精全成分進行有效提取，再采用UPLC/MS對其全成分進行表征。東北黃精、多花黃精及滇黃精色譜圖見圖1～圖3。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

由圖1、2、3可知，3種黃精中的大量成分得到表征，且主要色譜峰分離較好，對比各圖，發現不同產地3種黃精化學成分差異存在差異，其中檢測到的色譜峰數，東北黃精最多、多花黃精次之、滇黃精最少。

3.2 MS分析

按上述方法采集的MSE數據，獲取二級質譜碎片離子信息，與相關中英文文獻[2-16]資料比對，對“3.1”項下各色譜峰進行結構鑒定。并以黃精中41號色譜峰為例，說明分析步驟。圖4為41號峰的一級、二級質譜圖，在一級質譜圖中，m/z 1107的峰是準分子離子([M-H]-)峰，結合“Elemental Composition”數據處理及PubChem、MassBank、KEGG等網站查詢，基本確定該化合物為三萜皂苷類的人參皂苷Rb1，檢測到m/z 945，783，621，459的碎片峰，圖5為人參皂苷Rb1最可能的裂解途徑。

注：A.一級質譜圖；B.二級質譜圖。

圖5 黃精41號峰推測的質譜裂解途徑

在30 min內，東北黃精檢測到57個化合物，負離子模式下鑒定了55個化合物，正離子模式下鑒定了33個化合物。其中包括17個甾體皂苷類成分，14個黃酮類成分，5個三萜皂苷類成分，3個多糖及苷類成分，3個甾醇類成分，2個氨基酸類成分，2個生物堿類成分，1個香豆素類成分；多花黃精檢測到42個化合物，正離子模式下鑒定了34個化合物，負離子模式下鑒定了26個化合物。其中包括15個黃酮類成分，8個甾體皂苷類成分，4個多糖及苷類成分，3個三萜皂苷類成分，3個氨基酸類成分，2個甾醇類成分，1個生物堿類成分，6個其他；滇黃精檢測到30個化合物，正離子模式下鑒定了23個化合物，負離子模式下鑒定了18個化合物。其中包括11個黃酮類成分，6個甾體皂苷類成分，4個多糖及苷類成分，3個三萜皂苷類成分，2個生物堿類成分，1個氨基酸類成分，1個羧酸類成分，1個內源性核苷類成分，1個其他。3種黃精的質譜及鑒定結果見表1～表3。

表1 東北黃精化學成分的質譜信息

表2 多花黃精化學成分的質譜信息

4 討論

本實驗采用超聲波提取法以甲醇提取3種黃精藥材，采用UPLC/MS表征分析樣品所含化學成分，結果表明，3種黃精所含化學成分差異明顯，所建立的方法可用于區分3種黃精。此前已報道的黃精主要成分分析方法存在檢測成分少，檢測方法不完善等諸多問題。余亞鳴等[17]采用HPLC-MS法檢測了單一黃精中的化學成分，黃精品種少且方法靈敏度低；楊興鑫等[18]利用多元統計分析檢測3種基源黃精中化學成分，比較了3種黃精化學成分差異性，但未對化學成分進行結構鑒定。前期本課題組測定的東北黃精中總皂苷、總黃酮含量多于多花黃精及滇黃精[19]，此次研究發現東北黃精中化學成分種類也明顯多于多花黃精及滇黃精，多成分含量及種類體現出了東北黃精的質量優越性，本研究為東北黃精道地藥材資源和保健食品開發提供重要參考。