祛痰化瘀中藥復方對心房顫動模型大鼠心電圖及黏附分子P-Selectin、E-Selectin的影響

吳啟華，宮麗鴻，肖福龍

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110033；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032)

心房顫動(Atrial Fibrillation，AF)是最常見的慢性持續性心律失常，由于心房不協調的電活動而引起。我國流行病學調查顯示，心房顫動的發病率約為0.77%，隨著年齡增大而逐步增加[1]。AF可誘發心功能不全、腦栓塞及周圍血管栓塞，具有較高的致殘率和致死率，是當前臨床較為棘手的心血管疾病。

近年來，大量研究證明炎癥反應、氧化應激以及血栓的形成在房顫纖維化、電重構以及不良預后中起到重要驅動作用，黏附分子的作用與上述發病機制形成息息相關[2]。黏附分子在參與細胞間的識別、活化、信號轉導以及細胞的伸展與運動中起著重要作用，是一系列人體生理和病理過程如炎性反應、免疫應答、凝血、腫瘤細胞轉移、愈合創傷等的分子基礎[3]。趙爽等[4]研究表明，氧化應激時血管細胞黏附分子、P-選擇素及E-選擇素的表達水平明顯增加，即氧化應激介導黏附分子的活化與升高。而選擇素為黏附分子的一種，是一類異親型結合、Ca2+依賴的細胞間黏著分子，可與特異糖基識別并結合，主要參與白細胞、血小板與血管內皮細胞之間的識別與黏著，包括L-選擇素、P-選擇素(P-Selectin)和E-選擇素(E-Selectin)。

本實驗采用Ach-CaCl2混合液尾靜脈注射的方式進行大鼠AF造模，通過記錄大鼠心電圖AF的持續時間、心房肌細胞超微結構變化觀察祛痰化瘀中藥復方的療效，并進一步檢測AF大鼠血清黏附分子P-Selectin、E-Selectin含量以探討祛痰化瘀中藥復方的作用機制，為AF的中醫治療提供了有效的思路和方法。

1 材料

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠60只，體質量(350±50)g，購買于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物合格證號：SYXK(遼)2013-0009。飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，高脂飼料喂養，動物實驗符合遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會標準，實驗動物倫理審查編號：21000042021021。

1.2 藥物

祛痰化瘀中藥復方組成為桂枝6 g，炙甘草10 g，甘松10 g，龍骨25 g，牡蠣25 g，熟三七2 g，柴胡10 g，枳殼10 g，白芍10 g，僵蠶5 g，丹參15 g，竹茹10 g，陳皮15 g，半夏10 g，桑寄生10 g，由遼寧中醫藥大學附屬醫院熬制成100 mL/袋；鹽酸維拉帕米片(天津市中央藥業有限公司，國藥準字H12020051)，規格 40 mg/片。

1.3 試劑

氯化乙酰膽堿(Ach)(源葉生物科技有限公司,S30170-5g，CAS#60-31-1，分子式C7H16CINO2)；無水氯化鈣(CaCl2)(源葉生物科技有限公司,S24110-500 g，CAS#10043-52-4)；10%水合氯醛溶液(飛凈生物科技有限公司，規格：100 mL)；大鼠P選擇素試劑盒、大鼠E選擇素試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司)。

1.4 儀器

PowerLab 15T多導電生理記錄儀(上海埃德儀器國際貿易有限公司，型號：mL4818)；哺乳動物類手術器械一套；精密電子天平(丹佛儀器北京有限公司，京制00000249號)；SIS透射電鏡數字攝像頭(TEM CCD Camera)(德國EMSIS，型號：MORADA)；酶標儀(Model680，Bio-Rad，美國)。

2 方法

2.1 造模方法與分組

60只雄性SD大鼠隨機分為空白組(Control組)10只和造模組(Model組)50只，本實驗參照陳春林《大鼠心房顫動模型的建立》[5]中造模方法，連續7 d經大鼠尾靜脈注射Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)混合液制備AF大鼠模型，按0.1 mL/100 g計算給藥體積。

造模第7天，所有大鼠稱體質量，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉。連接PowerLab 15T多導電生理記錄儀，測量Ⅱ導聯心電圖，以心電圖中出現f波、P波消失，P-R間期絕對不等為AF發生的標志，以P波出現、f波消失為AF終止標志，計算出AF持續時間。將造模成功的50只大鼠隨機分成模型組(Model組)、中藥高劑量組(High dose組)、中藥中劑量組(Middle dose組)、中藥低劑量組(Low dose組)、維拉帕米組(Verapamil組)，每組10只。

2.2 藥物干預

造模成功后第2天灌胃，給藥劑量參考徐叔云主編的《藥理實驗方法學》[6]中關于人與動物按體表面積的等效劑量比值(1∶6.25)系數折算，中藥復方高、中、低劑量組分別給予41.25、20.63、10.31 g·kg-1·d-1灌胃，Verapamil組給予維拉帕米片25 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組給予生理鹽水灌胃，連續給藥2周。期間仍持續尾靜脈注射Ach-CaCl2，于灌胃1 h后進行。

2.3 檢測指標與方法

2.3.1 心電圖測量大鼠AF的持續時間

大鼠禁食不禁水12 h，稱體質量，采用水合氯醛麻醉。連接并測量Ⅱ導聯心電圖，動態觀察5 min。

2.3.2 透射電鏡觀察大鼠心房肌細胞超微結構

開胸暴露心臟后，用移液槍抽取戊二醛固定液，滴入活體組織上，剪取心臟，將心房肌修剪成1 mm3左右的小塊，放入盛有1 mL 4%戊二醛固定液的EP管中待用。

2.3.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清P-Selectin、E-Selectin的含量

記錄心電圖后，沿腹正中線向兩側剪開皮膚，暴露腹腔，進行腹主動脈采血,2 000 r/min離心10 min，ELISA法檢測各組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin的含量，按試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測OD值并計算濃度。

2.4 統計方法

3 結果

3.1 各組大鼠心電圖AF持續時間比較

造模后，所有大鼠均出現明顯房顫心電圖，造模成功率100%。與Control組比較，造模組均出現典型的AF(P<0.01)；與Model 組比較，用藥后大鼠AF的持續時間均明顯縮短，差異具有統計學意義(P<0.01)，組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1～2。

圖1 正常大鼠心電圖

表1 各組大鼠AF持續時間比較

3.2 各組大鼠心房肌細胞超微結構變化

透射電鏡結果顯示，Control組大鼠心房肌細胞的肌小節完整清晰，“Z”帶排列整齊連貫，I帶清晰可見，肌絲排列整齊緊密，線粒體結構正常，線粒體嵴結構完整。Model 組大鼠心房肌細胞的肌小節斷裂，“Z”帶不連續，排列混亂，“I”帶模糊不清，心肌細胞肌絲溶解斷裂，出現空隙，線粒體腫脹、增多，甚至破裂，嵴斷裂溶解，聚集在一起，呈空泡樣改變。High dose組、Middle dose組、Verapamil組大鼠心房肌細胞的肌小節輕微斷裂，排列相對整齊，肌絲稍有溶解，線粒體稍有腫脹、增多，但嵴溶解明顯減少，結構相對完整。Low dose組大鼠心房肌細胞的肌小節斷裂，“Z”帶不連續，排列不整齊，“I”帶模糊不清，仍有線粒體腫脹、增多，嵴斷裂溶解，個別線粒體結構不完整。見圖3。

圖2 房顫發生時心電圖

圖3 各組大鼠心房肌細胞超微結構變化(透射電鏡，×10 000)

3.3 各組大鼠血清P-Selctin、E-Selectin含量比較

與Control組比較，Model組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量顯著升高(P<0.01)；與Model組比較，中藥復方組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均明顯降低(P<0.01)；High dose組、Middle dose組較Low dose組降低更為顯著(P<0.05)，Verapamil組大鼠血清P-Selectin含量未見明顯改善(P>0.05)；High dose組、Middle dose組、Verapamil組大鼠血清E-Selectin含量均明顯降低(P<0.01)，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，而Low dose組大鼠血清E-Selectin含量未見明顯改善(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量比較

4 討論

在中醫學中，房顫屬于“心悸”“怔忡”等范疇。成無己《傷寒明理論·悸》曰：“其停飲者，由水停心下……水既內停，心不自安，則為悸也”[7]?！吨T病源候論》所言：“風驚悸者，由體虛，心氣不足，心之府為風邪所乘，或恐懼憂迫，令心氣虛”。故此中藥復方針對的心房顫動的發病機理為內有痰瘀之實，久則化火生風，風邪挾痰瘀擾動心之脈絡。本方在溫膽湯基礎上進一步創新化裁而來，《醫學入門》曰：“心與膽相通，心病怔忡，宜溫膽湯”。方中竹茹、陳皮、半夏、苦參、丹參、僵蠶為君藥，半夏、陳皮有“二陳”之意，燥濕化痰不言自明，竹茹清熱燥濕、化痰降氣共同調暢脾胃，使痰濕自化，丹參養血活血、祛瘀通絡，配伍僵蠶取其息風通絡之功效，以抑制“風動”之象；柴胡、枳殼、白芍、桑寄生為臣，共奏調暢氣機，交通心腎之效；白芍養陰柔肝、養血，抑制肝風，桑寄生入肝腎經，具有祛風、補肝腎的功用，二藥使氣機升降得暢，心腎水火既濟。心臟的正常搏動有賴于心之陽氣的推動和溫煦，是心搏跳動之源頭動力，論遂佐以桂枝甘草龍骨牡蠣湯意在振奮心陽，溫養心神，恢復正常竇房結功能[8]。甘松為使，行氣開郁，醒脾健胃，以化痰飲。全方共奏清熱祛痰化瘀、熄風定悸安神功效。

選擇素-P又稱CD62P，是分子量為140 kDa的跨膜糖蛋白。馬曉蕓等[9]研究發現，在基因水平上，P-Selectin的2123C>G、-1817T>C與房顫合并血栓具有明顯相關性。MIANMINO等[10]認為P-選擇素介導血小板黏附于內皮細胞, 激活中性粒細胞以及二者的黏附、聚集，釋放血管活性物質和氧代謝產物, 導致血管收縮, 啟動血栓形成，是血小板活化的標志。同時，因為P-選擇素對中性粒細胞具有趨化作用，還能上調單核細胞表達，并可導致單核細胞在損傷血管內皮的聚集，激活炎癥細胞，擴大局部炎癥反應[11]。選擇素-E，又稱CD62E，是分子量約為115 kDa的糖基化單鏈跨膜蛋白。有研究顯示，當人體內有嚴重的炎性反應出現時，血清中E-Selectin會出現高水平表達，特別在心血管疾病中[12]。E-Selectin只在內皮細胞上表達，可使激活的內皮細胞與中性多形核細胞、單核細胞、淋巴細胞黏附，反應機體炎癥反應和內皮功能，與房顫的發生發展密切相關。本實驗研究中，所有用藥組大鼠AF的持續時間均有不同程度降低(P<0.05)，用藥干預后肌絲排列相對整齊，線粒體結構相對完整，Model組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均升高(P<0.01)，用藥后二者含量出現不同程度的降低(P<0.01)，說明本中藥復方抑制了房顫過程中炎癥細胞和血小板的聚集，從而抑制了炎癥反應和血栓前狀態。

現代藥理學研究顯示，溫膽湯可能通過降低血脂、改善血中化學成分、增加紅細胞和血小板表面電荷，從而降低兩者之間的聚集，改善血液高凝狀態[13]。楊溶海等[14]研究表明丹參多酚酸鹽具有降低臨床急性心肌梗死患者血清中P-Selectin、E-Selectin的水平，可能機制為通過抑制血小板聚集、抗血栓形成、清除自由基、抗氧化、調節血脂代謝與內皮細胞功能[15]，進而達到穩定斑塊的作用。半夏可降低血液黏稠度、抑制紅細胞聚集和抗心律失常[16]；黃芩可改善血管,預防血栓的形成;三七主要活性成分三七總皂苷可調節COX2表達、抑制 COX1 表達、降低血小板上清液 TXB2 濃度，抑制 TXA2 途徑來抗血小板；保護內皮細胞抑制血小板黏附[17]。

綜上所述，祛痰化瘀中藥復方可降低大鼠AF的持續時間，改善心肌細胞超微結構的損傷，降低AF大鼠血清中P-Selectin、E-Selectin的含量，抑制血小板和炎癥細胞等活化和聚集，為AF的中醫治療提供新的治療思路和方法。