多粘菌素外排轉運蛋白的研究進展

俄文慧，王文龍*，周春燕，杜秉海，劉凱，汪城墻

(1.山東農業大學生命科學學院/山東省鹽堿地植物-微生物聯合修復工程技術研究中心/山東省農業微生物重點實驗室，山東 泰安 271018；2.山東農業大學動物科技學院(動物醫學院)，山東 泰安 271018)

隨著生活環境的復雜化，人類傳染性細菌和真菌疾病種類逐漸增多，一般的抗生素已滿足不了需求，多粘菌素被認為是治療耐多藥革蘭氏陰性細菌感染的最后一道防線[1]，其對幾乎所有致病性革蘭氏陰性菌具有治療作用。1947年，在多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)[2]中首次發現了多粘菌素，其是一類環狀脂肽類抗生素，對細菌細胞膜極具破壞力，具有優良的殺菌活性。

多粘菌素的產生菌多粘類芽孢桿菌是植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)[3]中的重要成員，廣泛存在于土壤生境和植物根部，可通過產生多粘菌素對植物的細菌病原菌起到拮抗作用[4]。多粘菌素被多粘類芽孢桿菌合成后，需要借助于外排轉運蛋白轉運到胞外發揮拮抗功能。多粘菌素外排轉運蛋白在一些多重耐藥細菌(MDR)中也廣泛存在。隨著臨床中抗生素的大量使用，一些病原菌也逐漸對多粘菌素等抗生素產生耐藥性，如銅綠假單胞菌[5]、鮑曼不動桿菌[6]、肺炎鏈球菌等，其中的耐藥機制之一就是多粘菌素外排轉運蛋白的存在[7]。本文對目前鑒定的多粘菌素外排轉運蛋白的類型、結構和轉運特征等進行介紹。

1 多粘菌素的結構與合成過程

多粘菌素的結構特征與其跨膜分泌緊密相聯。多粘菌素的基本結構是一個十肽序列，包括一個七肽環、一個三肽側鏈和脂肪酸鏈(圖1)，第10位的氨基酸L-Thr和第4位的2，4-二氨基丁酸(L-Dab)環化形成一個七肽環，不同的氨基酸殘基形成不同的多粘菌素類型[8]。多粘菌素B和多粘菌素E由于毒性小，抗菌活力強，已被應用于臨床[9]。多粘菌素由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)合成[10]，NRPS是具有模塊化結構的多酶復合物，直接將一種或多種特定氨基酸合成最終產物[11]。多粘菌素合成基因簇由5個開放閱讀框組成:pmxA、pmxB、pmxC、pmxD和pmxE，其中，pmxA、pmxB和pmxE編碼多粘菌素的NRPS，而pmxC和pmxD編碼多粘菌素外排轉運蛋白[12]。

圖1 多粘菌素B和E的化學結構[7]

2 多粘菌素外排轉運蛋白類型、結構特征及其研究進展

多粘菌素由多粘類芽孢桿菌合成和分泌，但目前對其跨膜分泌機制尚不明確，只鑒定出了兩個多粘菌素高活性外排相關轉運蛋白PmxC和PmxD[13]。本課題組前期研究顯示[14]，在多粘類芽孢桿菌中有多種膜蛋白和多粘菌素的分泌有相關性，需要進一步挖掘和鑒定其多粘菌素外排譜。

MDR的耐藥機制集中在改變或減少脂多糖的凈負電荷[15]，減少孔蛋白途徑，形成囊泡和過度囊泡，以及增加多粘菌素等藥物外排[1]。多粘菌素雖然是治療多重耐藥菌的最后一道防線，但一些MDR也會出現對多粘菌素的耐藥性。多粘菌素外排過程主要由膜外排轉運蛋白起作用。目前，在一些MDR中鑒定出了不同類型的多粘菌素外排轉運蛋白，主要涉及5種類型:耐藥結節細胞分裂家族(RND)、ATP結合盒家族(ABC)、主要促進因子家族(MFS)、多藥和有毒化合物輸出家族(MATE)及小多藥耐藥家族(SMR)[16]。

2.1 多粘菌素RND外排系統

2.1.1 RND型外排系統結構 RND外排系統一般存在于革蘭氏陰性MDR，由內膜轉運蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白組成三聯復合體，底物通過雙層細胞膜直接排出。RND型家族外排轉運蛋白由12個跨膜螺旋結構域(TMs)組成，在TM1和TM2以及TM7和TM8之間有兩個大的胞外環，跨膜區的4個高度保守的帶正電荷氨基酸殘基是參與底物結合與轉運的重要位點[17]。一些RND外排泵前后還存在阻遏蛋白，如smeR、cmeR等可控制外排轉運蛋白的表達量。

2.1.2 多粘菌素RND家族外排系統的研究 目前已鑒定的與多粘菌素外排相關的RND外排系統見表1。

表1 多粘菌素RND家族外排系統

在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌都普遍存在的AcrAB-TolC是RND外排泵的典型代表(圖2)。AcrAB-TolC由膜融合蛋白AcrA、外排轉運蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC組成。在肺炎克雷伯菌中敲除acrB基因，菌株對多粘菌素的敏感性增強，抗菌肽減少[18，19]。AcrB橫跨內膜，TolC橫跨外膜，AcrA包圍纏繞AcrB與TolC的外周胞質部分。多粘菌素等藥物一般是從AcrAB-TolC中央孔道直接排出[20]。AcrA的N端脂質部分錨定在內膜上[21]。AcrA有一個原核脂蛋白信號肽，在其成熟序列的N端和C端各有1個疏水區，脂質化的N端鑲嵌在內膜上，C端伸展到周質。膜融合中，AcrA起著連接作用，AcrA的C端與AcrB相互關聯，而AcrA的N端在C端的協助下與TolC相互作用，AcrA能把AcrB和TolC聯系起來[20]。AcrB主要作用是攝取和轉運多粘菌素等底物，三個AcrB形成同型三聚體，橫跨細胞內膜，由外周胞質部分和跨膜部分組成。AcrB帶有12個TMs，在每個跨膜結構域中存在偽雙重對稱軸，即六個N末端螺旋與六個C末端螺旋對稱排列?？缒^域包含三個功能上必需的帶電殘基:Asp407、Asp480和Lys940。AcrB帶有2個大的外周胞質發夾環，是其底物特異性的主要決定因子[22]。RND家族中的許多外排轉運蛋白都與TolC類型蛋白相連。TolC位于外排泵AcrABTolC的最外側，由跨膜部分和外周胞質部分組成?？缒げ糠趾?2個β折疊，穿越外膜，向胞外開放，內徑為底物排出提供寬闊通道；外周胞質部分通過α螺旋卷曲可以開啟、關閉外膜通道入口[23]。

圖2 RND型外排系統AcrAB-TolC的模式圖[22]

除了多粘菌素外排泵AcrAB-TolC外，在其他細菌中也發現了不同的RND家族多粘菌素外排轉運蛋白。來自脆弱擬桿菌的外排泵BmeABC也與多粘菌素外排有關[24]。其中，BmeB是具有16個TMs的外排轉運蛋白，BmeB也具有類似AcrB的三級結構[25]，BmeABC外排泵在殘基1 500和2 140之間還具有一段特殊的保守氨基酸序列。

在空腸彎曲桿菌中的CmeABC和CmeDEF外排系統可介導抗生素耐藥和維持細胞活力。CmeDEF外排泵在空腸彎曲桿菌中主要輔助CmeABC的外排。這兩個外排泵參與了空腸彎曲桿菌細胞活力的維持。CmeABC與其他革蘭氏陰性細菌中已知的多藥外排泵具有結構同源性，其由周質融合蛋白CmeA、內膜轉運蛋白CmeB以及外膜蛋白CmeC組成[26]。CmeB有12個TMs，在TM1和TM2、TM7和TM8之間有兩個大環結構[27]。對兩種空腸彎曲桿菌NCTC 11168和81-176進行試驗結果顯示，菌株11168 CmeF突變后相比野生菌株對多粘菌素的抗性降低了2倍，菌株81-176進行CmeE、CmeF雙突變和CmeE單突變后相比野生菌株對多粘菌素敏感性增加了2倍[28]。在CmeABC上游有一個開放閱讀框(ORF)，被命名為CmeR，其可以調控CmeABC的外排[29]，而CmeDEF不受CmeR的調控。

鮑曼不動桿菌的兩個外排泵AdeABC和AdeFGH與多粘菌素外排緊密相關。Verma等[30]研究顯示，外排泵AdeABC與多粘菌素的結合親和力最強。Sato等[31]證明，在多粘菌素B存在下，編碼外排轉運蛋白的adeB基因轉錄水平與外膜蛋白A(ompA)以及生物膜相關蛋白(bap)的mRNA表達水平正相關。AdeR和AdeS共同響應刺激從而調節AdeABC的表達[32]。Sato等[31]也證明，adeG的表達水平與多粘菌素的存在與否呈正相關；adeFGH基因的表達受LysR型轉錄調節因子(LTTR)的調控[33]。

銅綠假單胞菌可通過外排泵MexAB-OprM和MexXY-OprM外排多粘菌素[34]。外排泵Mex-AB-OprM中的MexB是外膜轉運蛋白，形成不對稱同源三聚體，其中每個單體均表現出由12個TM(TM1～TM12)組成的復雜拓撲結構，以及由TM1和TM2之間以及TM7和TM8之間的兩個長環形成的寬周質結構域，這些周質結構域折疊成六個亞結構域，存在保守帶電殘基Asp407、Asp408和Lys939[34]。外排泵MexXY-OprM中的MexY作為轉運蛋白，底物特異性幾乎完全由其周質結構域決定。MexB和MexY轉運蛋白利用質子動力將多粘菌素等藥物輸出到外部介質[35]。Morita等[36]在研究外排泵MexXY-OprM時，發現在其上游的一個調控基因ParRS會影響MexXY外排泵基因的表達，并賦予對多粘菌素的抗性。

VexAB-TolC外排泵可外排多粘菌素等抗生素并賦予霍亂弧菌抗藥性。Bina等[37]在霍亂弧菌中突變VexAB，結果表明突變菌株對多粘菌素B的最低抑菌濃度(MIC)降低，外排泵VexAB將多粘菌素B作為底物。TetR家族轉錄調節因子VexR位于編碼膜融合蛋白VexA上游，起調控VexAB的作用[38]。

Eda等[39]在苜蓿根瘤菌中發現，外排泵Sme-AB-TolC中的TolC基因突變后，相較于野生菌株，突變株對多粘菌素B敏感性增強，并且推測基因smeAB的表達由SmeR與SmeAB中反向序列的結合所介導。

對嗜麥芽窄食單胞菌外排泵SmeYZ的研究發現，PhoP可調節SmeZ的表達，敲除PhoP的菌株與野生菌株相比，SmeZ表達量顯著降低，且對多粘菌素B的MIC降低，回補PhoP后，SmeZ表達量恢復到野生型水平，且對多粘菌素B的MIC恢復到野生型水平[40]。

腦膜炎雙球菌可以抵抗陽離子抗菌多肽，外排泵MtrCDE對多粘菌素B存在特有的抗性[24]。MtrD外排轉運蛋白嵌入內膜，并將藥物從周質和內膜輸出到MtrE外膜通道。MtrD包含底物結合位點，并通過H+反向轉運機制傳導藥物輸出所需的電化學能[41]。2014年，Bolla等[42]解析MtrD多藥外排泵的晶體結構，每個MtrD的N端(TM1～TM6)和C端(TM7～TM12)存在偽對稱關系。

伯克霍爾德氏菌的外排泵AmrAB-OprA和BpeAB-OprB參與多粘菌素的外排，AmrAB-OprA的amrB基因或BpeAB-OprB的bpeB基因突變會減少菌株對多粘菌素的外排，而超表達兩個基因則能增強菌株對多粘菌素等抗生素的抗菌活性[43]。

2.2 多粘菌素ABC家族外排轉運蛋白

2.2.1 ABC型外排轉運蛋白的結構基礎 ABC型外排轉運蛋白的基本結構由兩個跨膜結構域(TMDs)和兩個核苷酸結合結構域(NBDs)組成，TMD提供底物轉運通道，NBD水解ATP提供能量[44]。在細菌中，ABC型外排轉運蛋白的單個TMD一般擁有6個跨膜螺旋(TM)，通常以同型或異型二聚體形式存在[45]。

2.2.2 多粘菌素ABC型外排轉運蛋白的研究目前，在革蘭氏陽性細菌中鑒定出兩個多粘菌素ABC型外排轉運蛋白(AbcAB和PmxCD)。AbcA和AbcB為異型二聚體ABC型多藥轉運蛋白，Margolles等[46]通過將短雙歧桿菌AbcAB異源表達到乳酸乳球菌中，經過微生物藥物敏感性測試，發現AbcAB提高了乳酸乳球菌對多粘菌素B的抗性。在對多粘類芽孢桿菌外排多粘菌素轉運蛋白的研究中，Choi等[13]推測PmxC和PmxD可外排多粘菌素，Shaheen等[12]進一步通過單獨敲除PmxC或PmxD，和共同敲除PmxC和PmxD，在單突變體以及雙突變體中都觀察到多粘菌素產量顯著減少。本課題組在多粘類芽孢桿菌SC2-M1中敲除PmxC和PmxD也得到了與Shaheen等[12]相似的結果，進一步證明了PmxC和PmxD外排多粘菌素的功能。

在革蘭氏陰性菌中也解析出了多粘菌素ABC外排轉運蛋白。其中，MacABCsm外排轉運蛋白由MacAsm、MacBsm和MacCsm形成三元操縱子，可外排多粘菌素，并有助于菌株的氧化和包膜應力耐受性以及生物膜形成。Lin等[47]在嗜麥芽窄食單胞菌中構建MacABsm突變體ΔMacAB，與野生型菌株相比，突變菌株顯著降低了對多粘菌素B和多粘菌素E的MIC。Crow等[48]研究表明MacAB-TolC的表達增加了大腸桿菌對多粘菌素和桿菌肽的抵抗力，MacB蛋白通過協調其NBD的可逆二聚化與周質構象變化來轉運底物(圖3)。在大腸桿菌中MacB為二聚體，每個MacB單體均包含一個N端NBD、四個跨膜α-螺旋(TMH)、以及TMH1和TMH2之間的周質結構域。TMH3和TMH4堆積在螺旋束的外部，由一個短的胞質外環連接[45]，這是ABC型轉運蛋白的典型結構[49]。

圖3 ABC型外排轉運蛋白MacAB-TolC的模式圖[45]

2.3 多粘菌素MFS家族外排轉運蛋白及其研究

MFS家族的外排轉運蛋白通常含有12～14個TMs，通過膜融合蛋白與外膜蛋白組成三聯復合體，將有毒化合物排出[50]。在肺炎克雷伯菌中敲除KpnGH基因及回補，證實KpnGH影響肺炎克雷伯菌的生長和生物膜形成能力，藥敏試驗結果表明，KpnGH基因敲除菌株比野生菌株對多粘菌素敏感性降低。KpnG有兩個疏水跨膜區，跨越氨基酸23～45和55～77；KpnF有13個跨膜區，跨越氨基酸16～38、52～73、76～98、106～128、138～160等[51]。

鮑曼不動桿菌中的外排泵EmrAB-TolC對多粘菌素E具有耐藥性。在Lin等[52]的試驗中，將A1S_1772和A1S_1773作為EmrAB系統的代表，分別命名為EmrB和EmrA，敲除鮑曼不動桿菌中EmrB基因，相較于野生菌株，敲除菌株對多粘菌素敏感性增加，并且通過熒光定量PCR試驗證明經過多粘菌素E處理的菌株和野生菌株相比，A1S_1772和A1S_1773上調1.3～1.6倍，EmrAB泵系統與鮑曼不動桿菌中的多粘菌素E外排相關。鮑曼不動桿菌的EmrB是編碼490個氨基酸的外膜轉運蛋白，EmrA具有較大的可溶性C末端結構域(圖4)。EmrAB復合物的電子顯微鏡單顆粒分析顯示，存在約240×140?的粒子結構，對應于兩個背對背排列的EmrAB二聚體[53]。

圖4 MFS家族外排轉運蛋白EmrAB-TolC的模式圖[45]

2.4 多粘菌素MATE家族外排轉運蛋白及其研究

來自于越南伯克霍爾德菌的NorM蛋白(圖5)是MATE家族的典型代表，NorM轉運蛋白有12個TMs。由TM1～TM6和TM7～TM12構成的兩束6跨膜螺旋形成一個空腔。胞質環將兩個部分相連[54]。越南伯克霍爾德菌野生菌對多粘菌素不敏感，通過對NorM蛋白編碼基因的敲除和回補試驗，證實NorM蛋白與伯克霍爾德菌對多粘菌素B的敏感性正相關[55]。

圖5 MATE家族外排轉運蛋白NorM的模式圖[56]

2.5 多粘菌素SMR家族外排轉運蛋白及其研究

SMR家族外排轉運蛋白單體一般含有4個跨膜α-螺旋結構，以二聚體形式通過構象變化泵出多粘菌素等藥物[56]。Srinivasan等[57]在肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中突變SMR家族外排泵KpnEF的基因，突變菌株相比野生菌株對多粘菌素E敏感性增加，證明外排泵KpnEF與肺炎克雷伯菌對多粘菌素的外排功能有關。EbrAB為KpnEF的同源蛋白，圖6為EbrAB模式圖，可推知KpnEF的結構。

圖6 SMR家族外排轉運蛋白EbrAB的模式圖[58]

3 總結與展望

多粘菌素相關外排轉運蛋白目前主要來源于產多粘菌素的多粘類芽孢桿菌以及MDR，如鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等。目前MDR的多粘菌素耐藥機制是研究熱點，其中，多粘菌素外排蛋白起到重要作用。部分多粘菌素外排轉運蛋白的晶體結構已經被解析，可深入探究其外排機制。而對于產多粘菌素的多粘類芽孢桿菌中的多粘菌素外排轉運蛋白的研究不充分，目前僅通過間接試驗證實PmxC和PmxD與多粘菌素的外排過程相關，因此對于多粘類芽孢桿菌中其他潛在的多粘菌素外排轉運蛋白的發掘以及轉運機制的解析是十分必要的。

根據序列相似性，多粘菌素外排轉運蛋白可分為5種類型，其中RND家族中與多粘菌素外排相關的轉運蛋白較多，主要存在于MDR中。揭示MDR菌株中的多粘菌素外排轉運蛋白有助于研究和解決病原菌耐藥性難題?？偨Y多粘菌素相關外排轉運蛋白及其特性，可為深入研究外排轉運蛋白介導的細菌多重耐藥性提供參考，也為進一步提高多粘類芽孢桿菌的多粘菌素產量提供理論依據。