合肥市三家醫院鮑曼不動桿菌的耐藥特征和碳青霉烯酶基因檢測

程志祥，邵小華，朱園園

鮑曼不動桿菌為不動桿菌屬的重要代表，主要引起醫院獲得性肺炎、血流感染等疾病，病死率較高，也是醫院感染控制的重要目標。近年來廣譜抗菌藥物的大劑量和不合理使用以及免疫抑制劑的影響，使鮑曼不動桿菌耐藥性顯著增加，已出現多重耐藥甚至是泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌[1]。自1985年首個碳青霉烯類藥物亞胺培南上市以來，成為臨床抗感染治療的一線藥物，而產生碳青霉烯酶是碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(CRAB)耐藥的主要機制之一。本研究旨在分析合肥市3家三級醫院(安徽醫科大學第四附屬醫院、中國科學技術大學附屬第一醫院、合肥市第二人民醫院)近年鮑曼不動桿菌藥物敏感性的變化，檢測碳青霉烯酶耐藥基因的分布情況，以期更好地控制耐藥菌株的傳播，為臨床個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1Whonet數據庫分析 回顧性分析2018年1月—2020年12月合肥市3家三級醫院Whonet 5.6數據庫相關資料，統計3年間分離出的鮑曼不動桿菌菌株數量和藥敏結果變化情況(剔除同一患者相同部位重復菌株及同一患者分別在三個醫院住院的重復病例)。

1.2菌株來源 針對3家醫院2018—2020年凍存的非重復鮑曼不動桿菌，根據數據庫藥敏試驗結果隨機選擇碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌(CSAB)和CRAB的菌株，復蘇后再次利用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統進行細菌鑒定和藥敏試驗，根據美國臨床和實驗室標準化協會抗菌藥物敏感試驗執行標準M100-S30文件[2]判讀藥敏結果，并且對CRAB經K-B法再次確認：亞胺培南抑菌圈直徑≤18 mm或美羅培南抑菌圈直徑≤14 mm。篩選出對照組15株CSAB和耐藥組44株CRAB，共59株臨床菌株。

1.3儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統[梅里埃診斷產品(上海)有限公司]，藥敏卡片采用VITEK 2 AST-N335。PCR擴增儀(艾本德中國有限公司)，核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像系統(美國BIO-RAD Universal Hood Ⅱ)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR試劑盒為：2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，凝膠回收試劑盒：SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.4耐藥基因檢測 對-80 ℃標本庫保存的59株臨床菌株和鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606進行復蘇、純化，按照試劑盒要求進行DNA模板制備。參照文獻[3-6]，對產碳青霉烯酶的常見12種耐藥基因進行引物設計，引物序列詳見表1。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，脫色后用凝膠成像系統讀取結果，出現目的條帶為檢測基因陽性。將陽性條帶的PCR擴增產物純化后送通用生物系統(安徽)有限公司測序，將測得的序列在GenBank數據庫中進行基因相似性分析。

表1 12種碳青霉烯酶基因引物序列

1.5質量控制 按照美國臨床和實驗室標準化協會要求進行質量控制，質控菌株(鮑曼不動桿菌ATCC19606、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853)由國家衛生健康委員會臨床檢驗中心提供。

1.6統計學方法 應用Whonet 5.6 軟件對抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)、MIC50及MIC眾數進行分析。應用SPSS 26.0軟件進行統計學處理，計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗；不符合正態分布的計量資料以M(P25～P75)表示，比較采用兩獨立樣本的非參數Mann-WhitneyH檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1臨床分離鮑曼不動桿菌藥敏情況 2018—2020年3家醫院分離鮑曼不動桿菌的總數分別為662株、660株和813株，其中CRAB分離率分別為77.49%(513株)、66.67%(440株)和70.85%(576株)。無明顯連續變化趨勢。藥敏結果分析發現，頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、替加環素3年間耐藥率比較差異有統計學意義(P<0.01)。進一步分析，2020年這3種藥物的耐藥率明顯高于2019年(P<0.05,P<0.01)。除替加環素、黏菌素、米諾環素外，2020年各抗菌藥物耐藥率均>50%。各抗菌藥物耐藥率、MIC50、MIC眾數詳見表2。

表2 2018—2020年3家醫院分離鮑曼不動桿菌耐藥率、MIC50及MIC眾數變化

2.259株鮑曼不動桿菌臨床特點和藥敏結果分析 對照組15株CSAB來源于多個臨床內外科室，標本類型：分離自痰液、膿液、尿液各4株，胸腔積液、血液及引流液各1株。僅有1株對頭孢他啶出現耐藥，其余各抗菌藥物耐藥率均為0。耐藥組44株CRAB主要來自重癥醫學科，標本類型：分離自痰液33株、支氣管灌洗液8株、引流液2株、血液1株。耐藥組對黏菌素耐藥率為0，對替加環素耐藥率2.27%，對米諾環素耐藥率為18.18%，對其余抗菌藥物耐藥率均>70%。44株全部為多重耐藥鮑曼不動桿菌，20株為泛耐藥鮑曼不動桿菌，表現為頭孢菌素類、青霉素+酶抑制劑類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、葉酸代謝抑制劑類及四環素類同時耐藥，無全耐藥鮑曼不動桿菌。

除黏菌素外，2組不同抗菌藥物MIC分布水平比較差異均有統計學意義(P<0.01)。不考慮替加環素和黏菌素(2組均敏感)，對照組大多數抗菌藥物MIC中位值還有2個稀釋度才到敏感折點，耐藥組的MIC中位值則基本剛好位于耐藥折點上(頭孢他啶超出耐藥折點1個稀釋度，米諾環素則位于敏感折點上)。2組抗菌藥物MIC值比較具體見表3。

表3 2組鮑曼不動桿菌不同抗菌藥物MIC分布水平比較(mg/L)

2.359株鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶耐藥基因的檢測結果 對照組檢測出4種耐藥基因blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58和blaTEM，各自的表達率分別為86.67%、100.00%、33.33%、6.67%。耐藥組檢測出5種耐藥基因blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58、blaTEM和blaNDM，各自的表達率分別為100.00%、100.00%、2.27%、88.64%和6.82%。未檢出blaOXA-24、blaOXA-143、blaOXA-235、blaIMP、blaVIM、blaSIM和blaKPC。標準菌株ATCC19606僅檢出blaOXA-51。經統計學分析，耐藥組blaOXA-23、blaTEM陽性率高于對照組，而blaOXA-58陽性率低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。對照組盡管藥敏表現對碳青霉烯類藥物敏感，實際仍攜帶耐藥基因，除固有基因blaOXA-51外，尤以blaOXA-23最為常見，其次為blaOXA-58，blaNDM少見。耐藥組全攜帶blaOXA-51和blaOXA-23，共表達blaTEM的有39株(含20株泛耐藥鮑曼不動桿菌)，其中3株blaNDM陽性(均為泛耐藥鮑曼不動桿菌)，包括1株另外攜帶blaOXA-58，也是同時攜帶5種耐藥基因的唯一菌株。見表5。

表4 2組鮑曼不動桿菌攜帶碳青霉烯酶耐藥基因陽性率比較[株(%)]

表5 2組鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因共表達情況

2.4耐藥基因表達陽性菌株測序結果 代表菌株測序峰圖單峰形完整清晰，無雜峰干擾。將序列文件在NCBI網站上與標準菌株ATCC19606序列行BLAST序列同源性比對，5種耐藥基因比對成功。選取對照組某一菌株blaTEM測序及比對結果見圖1。

3 討論

鮑曼不動桿菌是臨床常見致病菌，其多重耐藥問題嚴重，全國細菌耐藥監測網CARSS歷年來發布的監測報告[7-8]，本研究3年間3家醫院分離出的不動桿菌對常用抗菌藥耐藥率幾乎全高于當年全國平均水平，這應該與醫院等級、地區差異等有關。而本研究中2020年鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、替加環素的耐藥率較前2年增長，說明本地區鮑曼不動桿菌耐藥形勢嚴峻。

在實際工作中，除了嚴格執行無菌操作，做好院內感染防控外，更應該根據國家關于抗菌藥物應用管理文件，如《抗菌藥物臨床應用指導原則》《抗菌藥物臨床應用管理辦法》和相關醫療機構管理制度等，提高醫務人員科學、合理應用抗菌藥物的能力和積極性。同時，也要加強檢驗學科建設，要采取綜合措施，一方面努力提高微生物標本送檢質量和比例，改進檢測方法和手段，盡量縮短檢測時間且保障結果的準確性；另一方面也可以通過參加院內各類疑難感染疾病會診，與感染科、ICU等重點科室積極溝通，參與醫院感染防控和藥事管理，不斷提高感染性疾病的診治能力。

產碳青霉烯水解酶是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物產生耐藥的重要機制[9]，包括以絲氨酸為活性中心的絲氨酸酶和以金屬離子為活性中心的金屬酶類。本研究中共檢出5種耐藥基因，包括blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58、blaTEM、blaNDM，其中blaOXA-23、blaTEM在CRAB中的攜帶率明顯高于CSAB。

blaOXA-51是鮑曼不動桿菌天然攜帶的基因，多位于染色體上，平時不表達或表達水平較低，水解碳青霉烯類藥物的能力較弱。blaOXA-23可以插入染色體和質粒中，通常由質粒介導傳播，也是碳青霉烯酶中最常見的基因。本試驗中blaOXA-51在所有菌株陽性表達，blaOXA-23除了在耐藥組菌株中全部陽性表達外，在對照組大部分菌株中也陽性表達，這同王俊等[10]研究結果較為一致。另有研究表明，位于blaOXA-23、blaOXA-51基因上游的插入序列ISAba-1是基因表達的強啟動子，可以使耐藥基因高度表達，從而增強對碳青霉烯類藥物的抗性[11]。因此本研究中對照組blaOXA-23基因雖然暫時無法判斷其來源，但推測其功能與插入序列ISAba-1相關，還有待擴大樣本量深入研究。

blaOXA-58基因位于非轉移性質粒上，產生的酶能分解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不分解超廣譜β-內酰胺類藥物。另外，本研究發現，對照組blaOXA-58陽性率高于耐藥組，但由于對照組納入菌株數較少，是否由于樣本有限造成這種差異尚待后續研究證實。另外關于CSAB中檢出blaOXA-58的報道很少，張吉生等[12]也發現有10%的CSAB表達blaOXA-58，而CRAB則完全沒有?？赡芷浔磉_本身存在異質性或與其他調控機制有關，其原因值得深究。

質粒上blaTEM的產物也屬于超廣譜β-內酰胺酶，對碳青霉烯類和頭霉素類藥物敏感，活性可被克拉維酸、舒巴坦等抑制劑抑制。本研究發現，在耐藥組中blaTEM陽性率高(88.64%)，與敏感菌株(6.67%)相比存在顯著性差異。鄭琳等[13]對102株泛耐藥鮑曼不動桿菌檢測發現，blaTEM陽性率76.47%，為超廣譜β-內酰胺酶基因中最高，與本研究結果一致。

blaNDM屬金屬β-內酰胺酶[14]。由于其對β-內酰胺類抗菌藥物強大而廣泛的水解能力，導致目前產金屬β-內酰胺酶菌株已呈全球范圍播散，成為嚴重威脅人類健康的“超級細菌”。本研究發現的3株攜帶blaNDM的菌株均為泛耐藥鮑曼不動桿菌。國內陳嬌等[15]、周亞玲等[16]均報道，blaNDM-1在CRAB中陽性率分別為26.56%(17/64)、26.76%(19/71)，遠高于本研究的6.82%(3/44)。同時，也有許多未檢出blaNDM-1的報道[17-18]。因此認為其在我國的分布存在地區差異，尚未形成流行趨勢。

總之，本地區鮑曼不動桿菌對于抗菌藥物的耐藥性相當嚴重，CRAB攜帶碳青霉烯類耐藥基因主要為blaOXA-23、blaOXA-51、blaTEM，并且普遍存在多個耐藥基因共表達。因此應嚴格做到院內抗菌藥物應用的規范化管理，促進實驗室與臨床科室密切溝通，強化臨床醫師合理使用抗菌藥物意識，注重耐藥菌感染預防控制，盡可能地減少多重耐藥菌的產生和擴散。