ATF6對骨肉瘤MCA205細胞免疫原性的調控作用及其機制的初步探索

黃恩厚，李莫寒，李培培，夏琳，馬瑜婷（1.南京醫科大學 腫瘤個體化醫學協同創新中心，江蘇 南京 211166；2.中國醫學科學院 系統醫學研究院，北京 100005；3.蘇州系統醫學研究所，江蘇 蘇州 215123）

乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌等多種實體腫瘤細胞中均可觀察到內質網應激（ER stress，ERS）[1]，在晚期或化療抵抗的腫瘤中尤為明顯[2]。未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）是高度保守的ERS 響應機制。在UPR 的3 條分支通路中，活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）的研究進展相對緩慢。正常狀態下，ATF6 與葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）結合。當發生ERS 時，大量錯誤折疊的蛋白可擠占結合GRP78，釋放出游離的ATF6[3]。ATF6 從ER轉移到高爾基體后，可被蛋白酶切割，產生含有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）的轉錄因子，增強分子伴侶蛋白、折疊酶及內質網相關蛋白質降解效應分子的表達[4-5]，有利于維持蛋白質穩態和細胞存活。

ATF6 通路的持續活化可幫助癌細胞抵抗ERS 引發的細胞死亡[6-8]、支持休眠癌細胞存活[9]、促進化療抵抗[10]、誘導上皮細胞間質化[11]，以及增強血管新生[12]。也有報道[13]顯示，ATF6 是決定C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）表達的早期轉錄因子，因此也具有促凋亡活性。浸潤腫瘤的髓系細胞也會發生ERS 和UPR，可造成免疫抑制和免疫耐受，促進炎癥，阻礙抗腫瘤免疫應答[14-15]。條件性敲除髓系細胞的Atf6后，腫瘤內多核型髓源抑制性細胞的免疫抑制功能顯著下降，腫瘤進展明顯延緩[16]。目前，ATF6 通路對癌細胞免疫原性（即腫瘤細胞被免疫系統識別和清除的能力）的影響尚屬未知[17]。本研究擬借助免疫健全和免疫缺陷小鼠模型，探索野生型（WT）和Atf6-/-癌細胞的免疫原性和體內成瘤能力的差異，并初步挖掘相關調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

C57BL/6N 和nu/nu小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：20220107Abzz0619000267、20220107Abzz061900076 5、20201209 Abzz0619000481）與 B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax 小鼠（Ifnar-/-，Jackson 實驗室）的飼養和實驗均在中國醫學科學院系統醫學研究院/蘇州系統醫學研究所的SPF級實驗動物中心完成，實驗方案已獲得蘇州系統醫學研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（批準號：ISM-IACUC-0072-R）。小鼠按隨機數字表法隨機分組，每組小鼠至少5 只，年齡和性別匹配，均為雌性，6～7 周齡，體質量為18～20 g。骨肉瘤細胞MCA205由法國國家健康與醫學研究院Guido Kroemer實驗室饋贈。表達ISRE-熒光素酶的成纖維細胞L929-ISRE 由北京大學蔣爭凡實驗室饋贈。293FT 細胞購自Thermo Fisher 公司。所有細胞均培養于含有L-谷氨酰胺和HEPES的高糖DMEM 培養基[BL304A 購自Biosharp 公司，額外添加含10% 胎牛血清（FBS-12A，購自Capricorn Scientific 公司）和100 U/mL 的青霉素和鏈霉素雙抗溶液（BL505A，購自Biosharp 公司]。LentiCRISPRv2（52961）、psPAX2（12260）和pMD2.G（12259）質粒均購自Addgene公司。

細胞轉染采用的FuGENE?HD Transfection Reagent（E2311）購自Promega 公司，聚凝胺（polybrene，107689）購自MERCK 公司，嘌呤霉素（ant-pr）購自InvivoGen 公司，細胞活力檢測試劑盒CKK-8（BS350A）購自Biosharp 公司，能量代謝檢測試劑盒Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit（103020-100）和Cell Mito Stress Test Kit（103015-100）均購自Agilent Technologies公司，細胞死亡檢測使用的PE Annexin V（640947）和DAPI（564907）分別購自BioLegend 公司、BD BioScience 公司，衣霉素（tunicamycin，Tm；654380）購自Sigma-Aldrich 公司。離子霉素（ionomycin；ab120116）和Rhod-4 染料（ab112157）均購自Abcam公司，組織消化酶Liberase?TL（05401020001）購自Roche 公司，DNase Ⅰ（260913）購自Millipore 公 司，IFN-γ 的ELISPOT 試劑盒（551083）和ELISA 試劑盒（430801）分別購自 BD Bioscience 和 BioLegend 公司，Dual-Luciferase?Reporter 試劑盒（E1960）、胞內ATP 檢測試劑盒（G7571）均購自Promega 公司，胞外ATP 檢測試劑盒（FLAA）購自Sigma-Aldrich公司，組織和細胞總RNA提取試劑盒（DP419）購自TIANGEN公司，逆轉錄試劑盒（RR047A）和基于SYBR Green 的qPCR試劑盒（RR820A）均購自TaKaRa 公司，CD90.2 抗體（105310）購自BioLegend 公司，Low-Tox?-M 兔補體（Cl3051）購自Cedarlane公司，IL-2（5 000 U/mL）購自江蘇四環生物制藥公司，熒光染料eFlour670（65-0840-85）購自eBioscience公司。

1.2 CRISPR-Cas9敲除MCA205細胞的Atf6基因

靶向Atf6基因的gRNA 序列為5'-TCG ACGTTGTTTGCTGAACT-3'，合成正義和反義寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA 片段，連接至線性化的LentiCRISPRv2 載體。上述gRNA 載體質粒、包裝質粒psPAX2和pMD2.G按照21∶15∶6的比例共同轉染293FT 細胞。48 h后，收集病毒上清液并添加4 μg/mL聚凝胺后感染MCA205細胞。感染后48 h，用4 μg/mL嘌呤霉素篩選5 d。從存活的細胞中分選單克隆并逐一測序鑒定。

1.3 CCK-8法檢測Atf6缺失對MCA205細胞活力的影響

將WT 或Atf6-/-MCA205 細胞接種在96 孔板中（每孔2×103個細胞、100 μL 培養基），用PBS 或12 μmol/L 的Tm 處理細胞，在指定時間點向培養基中加入CCK-8 試劑（10 μL），借助SpectraMax?i3x 多功能微孔讀板儀檢測450 nm 和600 nm 處的光密度（D）值，繪制細胞增殖或死亡曲線。

1.4 細胞能量代謝儀檢測Atf6缺失對MCA205細胞OCR和ECAR的影響

在XF-24 板中接種細胞（5×104個/孔）并培養過夜，用12 μmol/L 的Tm 預處理細胞8 h，檢測前將培養基更換為Seahorse XF 基礎培養基，37 ℃培養1 h。借助Seahorse XFe24 分析儀，按照試劑盒說明，依次注射10 mmol/L 葡萄糖（GLU）、1 μmol/L 寡霉素（Oligo）和100 mmol/L 的2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）后檢測細胞ECAR。依次注射1.5 μmol/L 寡霉素，1 μmol/L 線粒體氧化磷酸化解偶聯 劑（carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl hydrazine，FCCP）和0.5 μmol/L 魚藤酮/抗霉素（Rot/AA）后檢測細胞OCR。檢測完成后立即消化獲取每孔細胞，嚴格計數后用于數據的歸一化處理。

1.5 流式細胞術檢測Atf6缺失對MCA205細胞死亡的影響

在24 孔板中接種WT 或Atf6-/-MCA205 細 胞（1×105個/孔）。待細胞匯合度達到70%～80%時，用PBS 或12 μmol/L 的Tm 處理細胞16 h，Annexin V 和DAPI 染色后用流式細胞儀（BD LSRFortessa?）分析ERS誘導的細胞死亡。

NK細胞體外培養與殺傷檢測：收集新鮮骨髓細胞，借助紅細胞裂解液、CD90.2 抗體和Low-Tox?-M兔補體去除紅細胞和T 細胞。余下的細胞在含有5 000 U/mL IL-2 和10% FBSR 的PMI1640 培養基中培養7 d，每天半量更換培養基。如此獲得的NK 細胞分別與eFlour670預染的WT或Atf6-/-MCA205細胞按照不同的效靶比混合，共培養4 h 后借助Annexin V和DAPI染色檢測腫瘤細胞死亡。流式檢測結果用FlowJo軟件分析。

1.6 構建MCA205細胞小鼠移植瘤模型

在C57BL/6N、nu/nu或Ifnar-/-小鼠背部兩側皮下標注部位同時分別注射1×106個WT或Atf6-/-MCA205細胞，每隔2～3 d測量并記錄腫瘤的最大直徑及其垂直方向的腫瘤直徑，用兩者的乘積代表腫瘤大小，繪制生長曲線。

1.7 移植瘤組織及腫瘤細胞的基因轉錄水平分析

植瘤后7 d 剝離和收集腫瘤組織，獲取PBS或Tm（12 μmol/L）處理16 h的腫瘤細胞，分別提取樣本總RNA，NanoDrop?2000 分光光度計確定其濃度和純度。腫瘤轉錄組測序委托蘇州金唯智生物科技公司，由Illumina HiSeq X Ten 平臺完成。借助R 語言程序包（DESeq2、FactoMineR、ComplexHeatmap 和EnhancedVolcano）分析基因表達，繪制主成分分析、熱圖和火山圖。Atf6-/-較WT 腫瘤組織中顯著上調基因的GO富集分析由Metascape在線工具完成。腫瘤細胞mRNA 被逆轉錄為cDNA 后，可借助如下引物（表1）對特定基因轉錄水平進行PCR檢測。

表1 qPCR所用引物序列

1.8 ELISPOT 及ELISA 實驗檢測Atf6 缺失對效應T細胞活化的影響

小鼠皮下接種癌細胞7 d后，收集腫瘤組織并剪碎，用Liberase TL（0.4 Wünsch units/mL）和DNaseⅠ（200 U/mL）消化30 min，70 μm濾器濾過后制備單細胞懸液。在預先包被了IFN-γ 捕獲抗體的多孔濾膜板中分配細胞懸液（1×106個/孔），培養16 h，反復清洗后，借助IFN-γ 檢測抗體、辣根過氧化物酶（HRP）和顯色底物，依托CTL-Immunospot S6酶聯免疫斑點分析儀對腫瘤內分泌IFN-γ 的細胞進行定量分析。將Tm 預處理的WT 或Atf6-/-MCA205 細胞注射到小鼠后足掌皮下，7 d 后收集腘窩（引流）淋巴結制備單細胞懸液，上述細胞（1×106個）與Tm預處理的WT型MCA205 細胞（2×104個）共培養72 h，收集上清液并用ELISA試劑盒檢測IFN-γ豐度。

1.9 流式細胞術檢測Atf6缺失對胞內鈣離子動員的影響

將WT和Atf6-/-MCA205細胞接種于黑色光學底透微孔板（2×104個/孔），PBS或Tm（12 μmol/L）處理16 h后，用不含Ca2+的HBSS緩沖液制備Rhod-4染料溶液并與待測細胞混合，室溫下放置1 h。借助SpectraMax?i3x（激發波長540 nm，發射波長590 nm），先記錄本底信號30 s，加入離子霉素（10 μmol/L）刺激后每5 s收集一次信號，繪制鈣離子動員曲線。

1.10 化學發光法檢測Atf6 缺失對胞內外ATP 濃度的影響

Tm 處理WT 或Atf6-/-MCA205 細胞16 h，收集細胞上清液，梯度稀釋ATP 標準品，將50 μL 細胞上清液、標準品轉移到全白96孔板，與等體積的檢測工作液混合后立即用SpectraMax?L定量檢測化學發光強度，計算胞外ATP濃度。為檢測胞內ATP濃度，保留板孔底部細胞及100 μL 細胞上清液，加入等體積檢測工作液，室溫振蕩10 min，吸取100 μL混合液轉移至全白96孔板，用SpectraMax?L完成定量分析。

1.11 ISRE-熒光素酶報告細胞實驗檢測Atf6缺失對IFNα/β分泌的影響

將L929-ISRE 細胞接種于96 孔板中（5×104個/孔）過夜，加入Tm 預處理的WT 或Atf6-/-MCA205 細胞（1×105個/孔），共培養4 h 后棄上清液，加入80 μL裂解液充分震蕩30 min，取其中50 μL，采用Dual-Luciferase?Reporter 試劑盒（Promega，E1960）由SpectraMax?L測定IFNα/β分泌水平。

1.12 WB檢測Atf6缺失對腫瘤內死亡相關通路活化的影響

用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（A32959,購自Thermo Fisher Scientific 公司）的裂解液（P0013,購自Beyotime 公司）提取WT 和Atf6-/-MCA205 腫瘤組織的總蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸變性。用12.5%SDS-PAGE分離蛋白樣本，將蛋白印記電泳條帶轉移至硝酸纖維素（NC）膜，與如下抗體（1∶1 000稀釋）4 ℃反應過夜：GSDMD（ab209845）和GSDME（ab21519，購于Abcam 公司）、Caspase3（14220）和cleaved caspase3 抗 體（9661，購 自Cell Signaling Technology 公 司）。β-actin（HRP-60008，購 自Proteintech公司）用作內參對照。之后，NC膜與HRP標記的二抗室溫反應2 h，反復洗滌后用Amersham?ECL?Prime 試劑（RPN2232，GE 公司）在ChemiDoc?成像系統（Bio-Rad公司）中進行半定量分析。

1.13 ATF6基因表達與腫瘤臨床預后的相關性分析

借助TCGA 數據庫，分析ATF6表達水平與多種癌癥患者總體生存率的關聯，繪制Kaplan-Meier生存曲線，計算風險比（HR）、95%置信區間（CI）和Logrank檢驗P值。

1.14 統計學處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進行數據作圖和統計學分析。實驗至少有3個平行重復，所有實驗至少獨立重復2 次，計量數據以平均值±標準誤（SEM）來表示。對于體內成瘤實驗，首先計算每只小鼠腫瘤生長曲線下面積（AUC），之后分析不同組別小鼠AUC間的差異。采用Log-rank檢驗分析不同組患者Kaplan-Meier 生存曲線的差異。其他數據均采用雙尾非參數Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05則表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Atf6缺失對MCA205細胞生物學特性的影響

借助CRISPR-Cas9 技術對MCA205 骨肉瘤細胞的Atf6進行基因編輯，通過多輪DNA 測序篩選出基因序列的缺失的細胞單克?。▓D1A）。CCK-8法檢測結果（圖1B）顯示，WT 和Atf6-/-細胞在體外的活力和增殖速度相當；Tm預處理16 h，兩種細胞的活力均受到明顯抑制，且撤藥后兩者的活力均無法恢復。流式細胞術分析結果（圖1C）顯示，Tm 處理后，Atf6-/-細胞死亡比例低于WT 細胞（P＜0.01）。細胞能量代謝分析結果（圖1D、E）顯示，Tm 預處理后，WT 和Atf6-/-細胞的糖酵解（用ECAR 表征）和氧化磷酸化（用OCR表征）水平沒有明顯差異。內質網Ca2+動員是高度靈敏的ERS 標志物，且與細胞死亡密切相關[18-19]，可借助Rhod-4 對其進行實時監測。本研究發現，對經PBS及Tm預處理的腫瘤細胞，離子霉素可快速誘導其胞內Ca2+動員，之后逐步恢復穩態，而上述過程不受Atf6缺失的影響（圖1F）。上述結果提示，Atf6缺失不影響PBS和Tm處理后腫瘤細胞的活力和增殖、能量代謝、以及離子霉素引發的內質網Ca2+動員，但可降低Tm誘導的細胞死亡。

圖1 Atf6對腫瘤細胞活力、增殖、死亡、能量代謝和鈣動員的影響

2.2 Atf6缺失可增強MCA205骨肉瘤的免疫原性

在免疫健全的C57BL/6N 小鼠皮下接種WT 或Atf6-/-骨肉瘤細胞，可觀察到WT 腫瘤迅速生長，而Atf6-/-腫瘤的生長則明顯滯后（圖2A）。出乎意料的是，在免疫缺陷的nu/nu小鼠（T 細胞發育受阻）背部兩側皮下同時接種這兩種癌細胞時，雖然Atf6-/-腫瘤的生長仍略慢于WT 腫瘤，但是兩者均可快速生長（圖2B）。上述現象提示，免疫健全小鼠體內Atf6-/-腫瘤的滯長與T細胞激活密切相關。C57BL/6N小鼠接種癌細胞后第7天，WT與Atf6-/-腫瘤大小剛剛顯示出差異，收集此時的腫瘤組織并進行轉錄組測序，隨后進行主成分分析并繪制差異基因熱圖和火山圖，結果都顯示，兩者的基因轉錄譜圖存在明顯差異（圖2C、E）。GO 富集分析結果（圖2F）提示，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-腫瘤微環境中免疫防御應答、細胞因子分泌、炎癥反應、免疫細胞活化和遷移、Ⅰ型和Ⅱ型IFN應答、細胞殺傷相關的基因表達均顯著增強。ELISPOT 實驗結果（圖2G）顯示，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-腫瘤內分泌IFN-γ 的抗腫瘤效應細胞顯著增多（P＜0.01）。將經Tm 預處理的WT 與Atf6-/-癌細胞注射到C57BL/6N小鼠后足掌皮下，可刺激腫瘤抗原特異性T 細胞，使其在引流淋巴結（draining lymph node，DLN）中初次活化（prime）。收集上述DLN 并制備混合細胞懸液，用Tm 預處理的WT 癌細胞在體外再次刺激（boost），可誘導腫瘤抗原特異性T 細胞的再次活化并分泌IFN-γ。檢測結果（圖2H）顯示，與對照組相比，被Tm預處理的Atf6-/-癌細胞初次活化過的小鼠，其DLN 內T 細胞經體外再次刺激后，IFN-γ分泌水平顯著升高（P＜0.001）。在體外按照1∶1 和5∶1 的效靶比將NK 細胞分別與WT 與Atf6-/-癌細胞共培養，結果（圖2I）顯示，Atf6-/-癌細胞比WT 癌細胞更易被NK 細胞殺傷（均P＜0.05）。上述結果提示，Atf6缺失可增強腫瘤的免疫原性，促進效應T 細胞和NK細胞的免疫監視功能，塑造出抗腫瘤的免疫微環境。

圖2 Atf6缺失可增強MCA205細胞移植瘤的免疫原性

2.3 影響Atf6-/-MCA205細胞免疫原性的可能因素

細胞應激后釋放的“危險信號分子”ATP 和IFNα/β 是決定腫瘤免疫原性的重要因素[20-21]。Tm 刺激16 h 可誘導細胞發生ERS。本研究分別檢測了WT與Atf6-/-MCA205 細胞的胞內ATP、釋放至胞外的ATP及IFN-α/β 的分泌水平，均未發現明顯差異（圖3A～C）。因此，Atf6缺陷并不影響MCA205 細胞在ERS 狀態下釋放ATP 和IFN-α/β?；虮磉_分析結果（圖3D）顯示，Tm 刺激下Irf7和Irf3轉錄本的豐度在Atf6-/-細胞內顯著增加（均P＜0.001）。Irf7和Irf3是決定IFN-α/β 及諸多ISG 表達的關鍵轉錄因子基因。Irf3在IFN-α/β 轉錄的啟動階段發揮了核心作用，但其蛋白可被快速降解。IFN-α/β 與其受體IFNAR 結合后，可促進Irf7的轉錄，進一步增強IFN-α/β 的表達。因此，Irf7密切參與了IFN-α/β的正反饋調控[22]。本研究提示，ATF6 可抑制ERS 觸發的Irf7和Irf3表達。Tm 刺激后，雖然兩種細胞內Ifnb和Cxcl10轉錄本的豐度相當（圖3D），但是Irf7和Irf3在Atf6-/-癌細胞內的上調仍然可能促進IFN-α和多種ISG的表達，而這可能會增強腫瘤細胞的免疫原性。此外，本研究還探索了宿主因素對Atf6-/-腫瘤免疫原性的影響，重點關注抗腫瘤的效應T 細胞和IFNAR 信號通路[23-25]。雖然ATF6 缺陷型腫瘤在免疫健全小鼠體內會出現滯長，甚至自發消退，但其在缺乏T細胞的nu/nu小鼠體內可快速生長。接種于Ifnar-/-小鼠皮下的Atf6-/-腫瘤仍然會出現滯長和自發消退，但與接種在WT小鼠皮下的Atf6-/-腫瘤相比，其開始消退的“拐點”時間會明顯推遲，腫瘤生長的峰值也會更大（圖3E）。上述結果提示：機體免疫系統監視和清除Atf6-/-腫瘤的過程中，T 細胞是關鍵的效應細胞，而宿主的IFNAR信號通路也發揮了一定作用。本研究還借助WB法，比較了WT和Atf6-/-腫瘤組織內細胞死亡相關分子的表達水平和活化程度。Atf6-/-腫瘤組織中的caspase3 總量、切割后活化的caspase3 的豐度都明顯低于WT 腫瘤。作為介導焦亡的關鍵分子，焦孔素GSDME 和GSDMD 在WT 和Atf6-/-腫瘤組織中的表達水平相當，且兩者N 端片段的切割均未能檢測到（圖3F）。上述結果提示，Atf6缺失腫瘤的滯長和消退并非由于凋亡或焦亡通路的增強，更可能是因為抗腫瘤免疫應答的激活。

圖3 Atf6-/-MCA205細胞免疫原性的可能影響因素

2.4 ATF6低表達的腫瘤患者預后更好

為了驗證小鼠腫瘤模型中上述發現是否具有臨床相關性，本研究對腫瘤公共數據庫進行了挖掘。在肺鱗癌（495例患者）、頭頸鱗癌（363例患者）、宮頸鱗癌（304例患者）、膀胱癌（404例患者）隊列中，均發現ATF6表達低患者的總體生存期更長（圖4）。

圖4 腫瘤ATF6表達水平的臨床預后價值分析

3 討論

腫瘤發生、發展和治療過程中，多種不利的微環境因素可造成癌細胞的穩態失衡、激活自噬、UPR、氧化應激等高度保守的細胞應激反應，通過降解自身組分產生營養物質、減緩轉錄翻譯、降解錯誤折疊蛋白和抑制脂質過氧化物生成等，緩解癌細胞的生存壓力，幫助其存活、擴增及產生治療抵抗。當不利刺激因素持續存在，或應激反應不足以減弱或逆轉細胞損傷時，凋亡、程序性壞死、焦亡和鐵死亡等信號通路可被激活，啟動細胞的死亡程序[26]。

近年來，隨著“免疫原性細胞死亡”（immunogenic cell death，ICD）概念的提出，細胞應激和死亡通路對腫瘤免疫原性的影響成為新興的研究熱點。多項研究證實：放化療導致腫瘤細胞自噬、UPR、凋亡、程序性壞死，上述信號通路的激活可觸發危險信號分子的釋放，對增強腫瘤細胞的免疫原性至關重要。其中，ATG5、ATG7、caspase、RIP3或MLKL的缺失或阻斷可抑制ATP的釋放，RIP3或MLKL的缺失可降低HMGB1的釋放，均不利于抗腫瘤免疫的啟動[27]?；熯€可促進STAT3的磷酸化，該信號通路的活化不僅可以促進癌細胞的存活，還能抑制其Ⅰ型干擾素應答，阻礙抗腫瘤免疫的活化[28]。

UPR對腫瘤細胞免疫原性的影響仍然存在較大的認知空白?；熆杉せ畎┘毎牡鞍准っ窻 樣內質網激 酶（protein kinase-like ER-resident kinase，PERK）通路，該UPR 分支可促進鈣網蛋白（calreticulin，CALR）由ER 轉移到細胞膜外表面，增強癌細胞的免疫原性，幫助DC 攝取和提呈腫瘤抗原，激活效應T 細胞[29]。本研究重點關注ATF6 信號通路對腫瘤細胞免疫原性的影響，及其對機體自發（并非治療引發）的免疫監視功能的調控作用。雖然敲除Atf6不影響MCA205 細胞在體外的增殖和能量代謝，但是Atf6-/-MCA205 細胞在免疫健全小鼠體內的成瘤速度顯著降低，可出現滯長甚至自發消退。Atf6-/-腫瘤MCA205 細胞在Ifnar-/-小鼠體內仍然會出現滯長和自發消退，但其生長峰值和徹底消退所需時間均高于其在免疫健全小鼠內的對應參數。在nu/nu小鼠體內，WT 和Atf6-/-MCA205 細胞均可快速成瘤，兩者生長的差異顯著降低。值得注意的是，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-移植瘤組織內凋亡、焦亡通路的活化并未增強，甚至還有一定程度的減弱。上述現象提示，Atf6-/-MCA205 細胞體內成瘤減緩并非依賴于凋亡或焦亡通路的活化，其主要原因是效應T細胞的激活，腫瘤宿主的IFNAR 信號通路也發揮了一定的促進作用。腫瘤組織的轉錄譜圖分析提示，ATF6的缺失引發了腫瘤免疫微環境的重塑，IFN-α/β 相關應答、IFN-γ 通路、NK 細胞殺傷力、免疫細胞的活化和遷移均顯著增強。ELISPOT實驗也證實Atf6-/-腫瘤微環境中分泌IFN-γ的效應T細胞的豐度明顯提升。

借助Tm預處理模擬不利微環境因素的刺激，可觀察到Ⅰ型IFN應答的關鍵轉錄因子Irf7和Irf3的表達在Atf6-/-MCA205細胞中顯著高于WT細胞。誘導腫瘤細胞ERS 后用于prime-boost 實驗，發現Atf6缺失可促進腫瘤抗原特異性T 細胞的活化，增強其IFN-γ 分泌。此外，Atf6-/-MCA205 細胞對NK 細胞的殺傷更敏感。上述現象表明，ATF6是限制腫瘤細胞免疫原性的重要瓶頸。具體的分子機制有待在后續研究中深入挖掘。ATF6 是分子伴侶、折疊酶、ERAD 相關基因表達的重要調控因子[5]，其缺失可能加劇蛋白錯誤折疊，引發新生抗原表位的暴露。此外，IFN-α/β 和IFN-γ 可促進Ⅰ類和Ⅱ類MHC 分子的表達[30-31]，增強抗原的交叉提呈[32]，有助于增強腫瘤抗原的提呈。在黑色素瘤中，IRE1α-XBP1 和PERK 通路的活化可 能會抑制MICA、MICB、B7H6等應激誘導配體分子的表達，從而抑制NK細胞的殺傷功能。Atf6是否也能發揮類似的調控作用值得進一步探索?？傊?，敲除Atf6不僅能降低腫瘤細胞抵御不利環境的存活能力，還能增強其免疫原性，通過激活抗腫瘤免疫應答有效預防和治療腫瘤。對于多個癌種而言，ATF6低表達的患者，其總體生存時間更長。因此，針對該靶點開發抑制劑分子具有較好的應用前景。