TRIM59 通過結合BCLAF1 調控人皮膚黑色素瘤SK-MEL-2 細胞的惡性生物學行為

劉建敏，周亞凈，何潤之，段春勝（邢臺市人民醫院 手足外科，河北 邢臺 054001）

黑色素瘤是由產生色素的黑色素細胞惡性轉化、增殖而來。當黑色素瘤位于皮膚表皮的基底層，則被稱為皮膚黑色素瘤，這是最常見的黑色素瘤[1-2]。皮膚黑色素瘤的發病率在世界范圍內呈逐年上升的趨勢[3]。因此，關于皮膚黑色素瘤發病的分子機制研究對其高效診斷、治療甚至預防十分有必要。近年來發現，三結構域（tripartite motif，TRIM）家族蛋白通過調控腫瘤細胞的生物學行為來參與腫瘤的發生發展。三結構域蛋白59（tripartite motif-containing 59，TRIM59）是TRIM 家族成員之一，其能夠識別、結合特定的靶蛋白，調節蛋白的泛素化修飾，誘導靶蛋白進入蛋白酶體依賴的泛素降解過程，從而進一步調節靶蛋白參與的許多生物過程[4]。研究[4]發現，TRIM21 可通過調控Wnt/β-catenin 信號通路增強卵巢癌細胞的增殖能力。TRIM59 在腫瘤的發展過程中既具有促癌作用也有抑癌作用[6]，而其在皮膚黑色素瘤中的作用尚未可知。Bcl2相關轉錄因子1（Bcl2-associated transcription factor 1，BCLAF1）在多種細胞中發揮抗凋亡作用，但其在癌癥中具有雙重作用，其在皮膚黑色素瘤中的功能也尚不十分清楚。據以往研究[7]推測BCLAF1 在皮膚黑色素瘤中發揮致癌作用。通過Starbase 網站分析發現，在黑色素瘤中TRIM59 與BCLAF1 的表達存在負相關性，采用RBPsuite 預測到BCLAF1 為TRIM59 的蛋白結合基因之一。本研究旨在探究TRIM59 調控黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的潛在機制，及其與BCLAF1之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

36 例人皮膚黑色素瘤組織來自2019 年2 月至2021 年7 月間于邢臺市人民醫院接受手術的皮膚黑色素瘤患者。本研究經醫院倫理委員會審批通過[院科倫審：（2019）倫審第（04）號]，所有患者均簽署知情同意書。人表皮黑色素細胞HEMn-LP、人皮膚黑色素瘤細胞SK-MEL-2、UACC903 和A375 均購自美國菌種保藏中心，DMEM 培養基購自北京索萊寶生物科技公司，總核糖核酸提取試劑（TRIzol）、LipofectamineTM3000 脂質體均購自美國Invitrogen 公司，qPCR檢測試劑盒購自南寧建成生物科技有限公司，兔抗TRIM59、周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、細胞周期素依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、人腫瘤抑制蛋白（human tumor protein P53，TP53）、Bcl2 相關轉 錄因子1（Bcl2-associated transcription factor 1，BCLAF1）多抗、HRP 標記的二抗均購自上海艾博抗貿易有限公司，Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，細胞計數試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學研究所，遷移、侵襲Transwell 小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養與分組轉染

HEMn-LP、SK-MEL-2、UACC903、A375 細胞均使用含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗的DMEM培養基于37 ℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細胞培養箱中常規培養，每2 d更換一次培養液。

通過qPCR 實驗檢測SK-MEL-2、UACC903 和A375 細胞中TRIM59 mRNA 的表達水平，選擇與HEMn-LP 細胞相比TRIM59水平變化幅度最大的細胞（SK-MEL-2細胞）進行后續研究，進行分組、轉染。采用siDirect version 2.0 軟件（http://sidirect2.rnai.jp/design.cgi）設 計si-TRIM59 序 列（5′-CCCUGAACAUUA CAGGCAATT-3'）及其對照片段si-con，委托上海吉瑪公司合成。將SK-MEL-2 細胞分為3 組，使用LipofectamineTM3000 脂質體分別將si-TRIM59、si-con轉染入細胞作為si-TRIM59組、si-con組，另一組不進行任何轉染為Normal 組，轉染12 h 后更換新培養基再繼續培養36 h，共培養48 h，qPCR法檢測干擾是否成功。

1.3 qPCR 法檢測TRIM59、BCLAF1 mRNA 在黑色素瘤組織與細胞中的表達

TRIzol液提取對數生長期細胞RNA或充分研磨的腫瘤組織中的總RNA，并將其反轉錄為cDNA，作為模板，-20 ℃保存備用。使用qPCR試劑盒檢測模板中TRIM59的表達情況。GAPDH為內參，2-△△Ct法計算TRIM59的相對表達量。GAPDH的正向引物為5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物為5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'；TRIM59 的正向引物為5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物 為5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'；BCLAF1的正向引物為5′-TCTGGAATAGAAGGCACTCT AGG-3′，反向引物為5′-ACCCTCGTCTTTTAG AAACAGGA-3′。反應程序：95 ℃預變性50 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸50 s，共進行40次循環。

1.4 WB 法檢測沉默TRIM59 對SK-MEL-2 細 胞TRIM59、CCND1、CDK2、TP53、BCLAF1蛋白表達的影響

使用RIPA 裂解液充分裂解各組細胞，并提取總蛋白。使用BCA 定量試劑盒對蛋白定量，100 ℃沸水浴中使蛋白變性，結束后，用上清液做蛋白電泳上樣模板行SDS-PAGE，再用轉膜儀在0 ℃下將膠上的蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉液于37 ℃封閉膜2 h，PBS 洗膜3 次，浸入10 mL 稀釋的一抗溶液中，37 ℃反應3 h，洗膜后再浸入稀釋的二抗溶液，37 ℃反應1.5 h，洗膜，用ECL 試劑盒顯影、曝光。Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，用目的蛋白灰度與內參蛋白灰度之比表示蛋白的相對表達量。

1.5 CCK-8 法檢測沉默TRIM59 對SK-MEL-2 細胞增殖的影響

調整對數期的各組細胞至0.5×105個/mL，接種至96 孔板，每孔200 μL。細胞培養箱中分別培養24、48、72、96 h。取出細胞加入10 μL/孔的CCK-8溶液，震蕩混勻，避光反應25 min。用酶標儀檢測490 nm處細胞懸液的光密度（D）值，以D值代表細胞增殖水平。

1.6 流式細胞術檢測沉默TRIM59 對SK-MEL-2 細胞周期與凋亡的影響

細胞周期：收集對數期各組細胞，用PBS洗滌3 次。用預冷的70%乙醇固定，4 ℃固定30 min。洗滌，用RNase A 除去RNA，加入PI 染色（50 μg/mL），4 ℃避光培養30 min。上流式細胞儀分析細胞周期的分布情況。

細胞凋亡：用預冷的PBS 溶液洗滌對數期的各組細胞5次，再用結合緩沖液（500 μL）懸浮。先加入5 μL 的Annexin V-FITC 室溫避光反應20 min，再加入5 μL的PI繼續培養15 min，終止反應。300目篩過濾，上細胞流式儀檢測分析細胞凋亡。細胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 劃痕愈合實驗檢測沉默TRIM59 對SK-MEL-2細胞遷移能力的影響

取對數期的細胞，更換細胞培養液為含1%胎牛血清的DMEM培養液。培養約12 h，細胞鋪滿單層，匯合度達90%以上，用滅菌牙簽垂直板底劃線。洗去劃痕脫落的細胞，用低血清培養基繼續培養24 h，顯微鏡下觀察劃痕愈合的抑制情況。劃痕抑制率=（si-TRIM59 組寬度0h-si-TRIM59 組寬度24h）/（si-con組寬度0h-si-con組寬度24h）×100%。

1.8 Transwell 實驗檢測沉默TRIM59 對SK-MEL-2細胞遷移、侵襲能力的影響

將對數期的各組細胞，用含1%胎牛血清的DMEM 培養液饑餓處理12 h，調整細胞密度至0.5×104個/mL，待用。用含人工基膜的Trasnwell 小室檢測細胞侵襲能力，不含人工基膜的小室檢測細胞遷移能力。按照Transwell 小室說明書要求操作，上室鋪細胞，下室加含5%胎牛血清的培養基，培養12 h。結束后，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察細胞穿膜情況，采用五點法計數穿膜細胞，取平均值代表細胞的遷移或侵襲能力。

1.9 Co-IP實驗檢測TRIM59與BCLAF1的蛋白結合能力

將對數期的各組細胞，經RIPA處理后充分裂解，8 500×g離心10 min，取上清。將上清分別設為input組、IP:TRIM59組、IP:BCLAF1組。其中input組不添加任何抗體，IP:TRIM59 組加入TRIM59 抗體，IP:BCLAF1組加入BCLAF1抗體，混勻，4 ℃反應過夜。取出，加入蛋白A/G，繼續反應5 h，離心，收集沉淀。PBS充分清洗沉淀，用上樣緩沖懸浮細胞，煮沸變性，取上清液，用WB 法檢測TRIM59、BCLAF1 的表達情況。

1.10 統計學處理

實驗中的數據均用SPSS23.0處理。計量資料用均數±標準差表示，多組數據比較用單因素方差分析，組內兩兩比較用LSD-t檢驗。兩組數據比較用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 或P＜0.01 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM59 在人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中的表達及其與患者存活率的關系

WB 法（圖1）和qPCR（表1）檢測結果顯示，與HEMn-LP 組相比，SK-MEL-2、UACC903、A375 組細胞TRIM59 的mRNA 和蛋白表達均顯著升高（均P＜0.01）。gepia.cancer網站分析結果（圖2）顯示，TRIM59高表達患者的存活率降低。

表1 TRIM59 mRNA在人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中的表達（，n=9）

表1 TRIM59 mRNA在人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中的表達（，n=9）

與HEMn-LP組比較，**P＜0.01

圖1 人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中TRIM59蛋白表達及其對患者存活的影響

圖2 TRIM59蛋白表達水平對黑色素瘤患者生存率的影響

2.2 沉默TRIM59抑制SK-MEL-2細胞的增殖

WB 法（圖3）、qPCR（表2）檢測結果顯示，與sicon 組相比，si-TRIM59 組細胞TRIM59 的mRNA 和蛋白表達均顯著降低（均P＜0.01）；CCK-8 法檢測結果（圖4）顯示，在48、72、96 h 時si-TRIM 組細胞增殖水平顯著降低（均P＜0.05）。

表2 轉染si-TRIM59后SK-MEL-2細胞中TRIM59 mRNA的表達顯著降低（，n=9）

表2 轉染si-TRIM59后SK-MEL-2細胞中TRIM59 mRNA的表達顯著降低（，n=9）

與si-con組和Normal組比較，**P＜0.01

圖3 轉染si-TRIM59抑制SK-MEL-2細胞中TRIM59蛋白的表達

圖4 沉默TRIM59抑制SK-MEL-2細胞的增殖

2.3 沉默TRIM59誘導SK-MEL-2細胞周期阻滯

WB 法檢測結果（圖5A、B）顯示，與si-con 組和Normal 組相比，si-TRIM59 組SK-MEL-2 細 胞CCND1、CDK2 蛋白表達顯著降低（均P＜0.01）；流式細胞術檢測結果（圖5C）顯示，si-TRIM59 組SKMEL-2細胞周期阻滯于G2期（P＜0.05）。

圖5 沉默TRIM59誘導SK-MEL-2細胞周期阻滯并抑制CCND1和CDK2表達

2.4 沉默TRIM59促進SK-MEL-2細胞的凋亡

WB 法檢測結果（圖6A、B）顯示，與si-con 組和Normal 組相 比，si-TRIM59 組SK-MEL-2 細 胞TP53蛋白表達顯著升高（均P＜0.01）；流式細胞術檢測結果（圖6C）顯示，si-TRIM59組SK-MEL-2細胞凋亡率較si-con 組和Normal 組顯著升高[（13.35±1.87）%vs（5.10±0.78）%、（4.51±1.13）%，P=0.000、F=122.534]。

圖6 沉默TRIM59促進SK-MEL-2細胞的凋亡與TP53的表達

2.5 沉默TRIM59抑制SK-MEL-2細胞的遷移和侵襲

劃痕愈合實驗（圖7A）、Transwell實驗（圖7B）檢測結果顯示，與si-con 組和Normal組相比，si-TRIM59組細胞劃痕抑制率顯著升高（P＜0.01、F=602.589），遷移（P＜0.01、F=32.866）和侵襲（P＜0.01、F=40.398）細胞數均顯著降低。

圖7 沉默TRIM59抑制SK-MEL-2細胞的遷移和侵襲

2.6 TRIM59 與BCLAF1 間存在相互作用及其在黑色素瘤患者體內表達的相關性

RBPsuite 預測發現BCLAF1 能夠與TRIM59 結合（圖8A）。免疫共沉淀實驗結果（圖8B）顯示，TRIM59 與BCLAF1 之間存在相互作用。WB 法（圖8C）、qPCR法（表3）檢測結果顯示，與HEMn-LP細胞相比，SK-MEL-2、UACC903、A375 細胞中BCLAF1的mRNA和蛋白表達均顯著升高（均P＜0.01）。36例癌組織中TRIM59 與BCLAF1 的表達之間呈明顯的正相關（r=0.878，P＜0.001，圖8D）。利用Starbase 網站（https://starbase.sysu.edu.cn/pan GeneCoExp.php#）分析黑色素瘤患者體內TRIM59 和BCLAF1 表達相關性，結果（圖8E）顯示，兩者呈明顯的正相關（r=0.561，P＜0.001）。

圖8 TRIM59與BCLAF1存在互作關系

表3 人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中BCLAF1 mRNA的表達（，n=9）

表3 人皮膚黑色素瘤細胞和黑色素細胞中BCLAF1 mRNA的表達（，n=9）

與HEMn-LP細胞比較，*P＜0.05，**P＜0.05

3 討論

TRIM59 可能通過介導蛋白質之間的相互作用調節泛素調節蛋白的穩定性，越來越多的研究結果支持TRIM59 具有癌蛋白的功能[8]。TRIM59 參與部分腫瘤的發展，其表達水平在這些癌癥中隨著病情的惡化而上調[9]。JIN 等[10]對納入的46 項研究（包括11 558 名患者）進行分析發現，與相鄰組織相比，TRIM59 的表達水平在15 種類型的人類實體瘤中的顯著上調，TRIM59高表達組患者的總生存率明顯低于低表達組患者，并且TRIM59高表達預示著多發性實體瘤預后不良，表明TRIM59有可能被用作人類實體瘤的診斷和預后的標志物。KHATAMIANFAR等[11]發現，TRIM59在肺癌、腎癌等多種腫瘤組織中均表達上調，并與腫瘤發生、發展具有明顯的相關性；此外，該研究還通過小鼠全胚胎監測上皮細胞中TRIM59 上調的起源，揭示TRIM59 可作為一種新的多腫瘤標志物用于早期腫瘤的免疫組織化學檢測。也有研究[12]發現，TRIM59 在部分腫瘤中的表達異常降低，而進行過表達則有助于腫瘤的控制。因此，為了探究TRIM59在皮膚黑色素瘤中的表達及其功能，本研究檢測發現皮膚黑色素瘤細胞中TRIM59 呈高表達，而沉默TRIM59后，SK-MEL-2細胞發生增殖活性降低、G2 期阻滯，同時CCND1、CDK2 表達受到抑制，遷移侵襲能力也降低，凋亡率及TP53表達明顯升高。這說明TRIM59 能夠促進SK-MEL-2 細胞的惡性細胞表型發展。這與TIAN等[13]的TRIM59增強巨噬細胞的吞噬作用以抑制黑色素瘤生長的實驗結果相悖，與TRIM59在實體瘤中的致癌功能相一致。本研究中，免疫共沉淀實驗發現，TRIM59 與BCLAF1之間存在互作關系，提示BCLAF1可能與TRIM59在皮膚黑色素瘤細胞中的功能有關。

近年來，越來越多的實驗證據表明BCLAF1在腫瘤發展過程中發揮腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子的作用，其功能取決于腫瘤微環境及癌癥類型[14-15]。BCLAF1在肝癌、白血病、膀胱癌、結腸癌中促進癌細胞惡性表性變化，而在肺癌、骨肉瘤中抑制癌細胞的進一步惡化[16-17]。在肝癌的研究中發現，BCLAF1 的表達水平以HIF-1α 依賴性方式升高，有助于肝癌細胞的增殖，腫瘤的生長及血管的形成[18-20]。本研究發現，BCLAF1 在皮膚黑色素瘤細胞中的表達明顯升高，提示BCLAF1可能在黑色素瘤中發揮促癌基因的作用。進一步通過qPCR檢測發現，在皮膚黑色素瘤組織中BCLAF1 和TRIM59 表達水平之間呈明顯的正相關，并且在Starbase 中分析發現，在皮膚黑色素瘤中BCLAF1 的表達水平隨TRIM59的升高而升高，也呈明顯的正相關。本研究未進行BCLAF1 在皮膚黑色素瘤細胞及動物模型中的功能探討，課題組將繼續開展相關研究，為BCLAF1用于皮膚黑色素瘤患者的康復提供更充分的實驗支持。

綜上所述，TRIM59在皮膚黑色素瘤細胞中呈高表達，沉默TRIM59 抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲而促進凋亡，其發揮抗癌作用的潛在機制與TRIM59蛋白結合BCLAF1有關。