超高效液相色譜-串聯質譜法測定毛發中5種芬太尼類新精神活性物質的方法研究與應用

薛康 何嘉玲 吳雪梅 周鑫平 肖宇 胡江濤 何開蓉*

（1.成都海關技術中心 四川成都 610041；2.食品安全檢測四川省重點實驗室；3.四川百茶百道實業股份有限公司）

1 前言

芬太尼是20世紀50年代由比利時科學家保羅·楊森作為鎮痛藥開發的，是一種強效的阿片受體激動劑[1]。后來通過對芬太尼的結構進行不斷修飾，已出現了數十種芬太尼類衍生物，近年來，芬太尼類新精神活性物質的濫用已經引起國際社會的高度關注。2018年12月，中美元首會晤后，兩國在禁毒方面達成新的合作意向與共識，我國決定對芬太尼類物質進行整類列管，將其指定為受控的新精神活性物質，并列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》。

檢材是案件的重要證據，如血液、毛發、尿液、分泌液和胃容物等，是法醫毒物實驗室常用的生物檢材。生物檢材的處理關系到分析結果的科學性與準確度，會對案件的偵辦產生直接影響。血樣、尿樣及唾液在采樣及保存過程中易受污染而造成假陰性，且其檢出時間較短。因此，有時需要用易采集、易保存及檢測窗口較長的毛發來進行鑒定。毛發具有可長時間保留藥史等優點，可作為體液檢材的有效補充，有時，其甚至會成為提供法庭證據的唯一手段[2]。因此，本文選擇毛發樣品作為本次試驗的檢材。

目前對芬太尼類物質及其代謝物的檢驗方法主要有氣相色譜質譜聯用法[3-5]、液相色譜質譜聯用法[6-8]、液相色譜法[9]等。本文擬采用超高效液相色譜-串聯質譜法對毛發中5種芬太尼類物質進行精確定性與定量檢測，旨在建立一種靈敏度和準確度高、特異性和可操作性強的芬太尼類物質檢驗方法，為實際應用提供技術支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑、材料

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司）；3H20RI離心機（中國赫西）；AE240電子天平（瑞士梅特勒）；XW-80A旋渦混合器（中國HUXI）；B8510E-DTH超聲波清洗器（美國必能信）；Mili-Q Integral 3超純水儀（美國Millipore公司）。

芬太尼（Fentanyl，CAS 437-38-7）；羥化去甲芬太 尼（Hydroxynorfentanyl，CAS 83708-10-5）；乙 酰芬太尼（Acetylfentanyl，CAS 3258-84-2）；去甲舒芬太尼（Norsufentanil；CAS 61086-18-8）；2，3-司可芬太尼（2，3-seco-Fentanyl；CAS 253342-66-4）。其中，乙酰芬太尼標準品質量濃度為50 μg/mL，其他4種芬太尼標準品質量濃度為100 μg/mL。甲醇（HPLC級，Fisher公司）；乙腈（HPLC級，Fisher公司）乙酸銨（HPLC純，ACS公 司）；甲 酸（HPLC級，CNW公司），其他試劑均為分析純。

2.2 溶液配制

取各芬太尼標準品適量，用溶劑配制成1.0 μg/mL的混合標準品中間溶液；用初始流動相逐級稀釋成濃度為50.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 ng/mL的標準曲線工作液。

2.3 樣品處理

毛發樣品依次用適量水和丙酮振蕩洗滌2次；晾干后剪成約1 mm段；置于2 mL研磨管中，用毛發研磨器粉碎成粉末狀。

稱取毛發粉末20 mg，加入1.0 mL甲醇溶液，浸泡4 h；冰浴超聲30 min；加入1.0 mL初始流動相，6 000 r/min離心5 min；取1.0 mL上清液，過0.22 μm有機濾膜，供儀器分析。

2.4 儀器條件

2.4.1 質譜條件

離子化源模式：ESI+；霧化溫度：550℃；掃描方式：多反應監測方式（MRM）；毛細管電壓：2.83 kV；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；霧化氣40 psi。各化合物參數見表1。

表1 5種化合物的質譜參數

2.4.2 色譜條件

HSS T3色譜柱（100mm×2.1mm，1.8 μm，美國Waters公司），柱溫35℃；流動相A：5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸緩沖溶液，流動相B：乙腈；流速為0.30 mL/min，進樣量1.0 μL。采用梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

3 結果與討論

3.1 色譜條件的選擇

芬太尼類化合物的分子結構主要由丙基烷基酰胺、哌啶基環和苯基烷基部分組成，具有一定的極性，故本文采用HSS T3色譜柱。同時，實驗比對乙腈—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）、乙腈—水（0.1%甲酸）、甲醇—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）、甲醇—水（0.1%甲酸）4組流動相對目標物的選擇與分離效果。結果表明，將乙腈—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）作為流動相，5種目標物均能夠得到較好的分離度和峰形，譜圖見圖1。

圖1 5種芬太尼類物質總離子流圖

3.2 質譜條件的優化

本實驗采用正離子模式（ESI+）和多反應監測掃描方式（MRM）優化質譜參數。將100 ng/mL的芬太尼類物質標準溶液直接進樣分析，調節毛細管電壓，使一級質譜中基峰離子響應最強，二級質譜的母離子選擇一級質譜中的基峰離子，確定各化合物的母離子后，通過調節優化CE電壓和DP電壓，進行篩選最優子離子，保證子離子的靈敏度，5種芬太尼類物質的質譜參數見表1。

3.3 方法學驗證

3.3.1 線性范圍

取適量混合標準品中間液適量，用初始流動相逐級稀釋成質量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50 ng/mL的工作濃度。以每個目標物響應值為縱坐標（y），目標物質量濃度為橫坐標（x），最小二乘法進行回歸（權重系數為1/x），求得線性方程和線性系數。結果表明在質量濃度為0.5～50.0 ng/mL范圍內，5種芬太尼類化合物具有良好的線性關系，相關系數大于0.99。

3.3.2 檢出限和定量限

將配置的校準曲線樣品按照1.3方法進行處理并檢測，以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）計算檢出限和定量限，5種芬太尼類物質的檢出限均為0.01 ng/mg，定量限為0.03 ng/mg。

3.3.3 準確度、精密度和回收率

稱取數份20 mg空白毛發樣本，分別滴加適量的混合標準品溶液，晾干，配置成低（0.05 ng/mg）、中（0.2 ng/mg）和高（1.0 ng/mg）3個濃度的樣本溶液，經1.3方法處理后檢測，記錄每種芬太尼類物質在3個濃度的平均峰面積As，同時用甲醇稀釋混合標準品溶液，配置成濃度為0.1 ng/mL、4.0 ng/mL和20.0 ng/mL的對照品，上機檢測得到每種芬太尼類物質在這3個濃度的峰面積Am，以As/Am計算準確度，結果見表3。

將低（0.05 ng/mg）、中（0.2 ng/mg）和高（1.0 ng/mg）3個濃度的樣本每個配制6份，處理后分析，計算日內精密度，連續檢測3 d，計算日間精密度；同時計算加標回收率，結果見表3。

表3 各芬太尼類物質的準確度、回收率及精密度

3.4 方法應用

該試驗采用樣品添加的方式模擬實際案例。取適量毛發，浸泡在1.0 μg/mL的混合標準溶液中72 h，取出后晾干，按照2.3方法處理并做加標回收，提取液上機檢測，超高效液相色譜-串聯質譜方法如上文所述，5種芬太尼類新精神活性物質在此份毛發樣品中均被檢出且加標回收率在90.5%～108.5%之間。

4 結論

本文采用了UPLC-MS/MS技術建立毛發中5種芬太尼類新精神活性物質的檢測方法，該方法操作簡單，成本低、靈敏度高，可應用于臨床試驗毛發檢材中芬太尼類新精神活性物質的檢測，滿足檢驗鑒定的要求。芬太尼類物質作為一種新精神活性物質，已被整類列管，由于其藥性極強，成癮性很高，因此需要相關部門的重視，加強技術投入，嚴格監控芬太尼類物質的濫用情況。