頂空氣相色譜法測定人干擾素α2b原液中乙腈殘留量

馮雪 李野 劉華 李婷婷 王佳欣 楊紅育

（長春生物制品研究所有限責任公司 吉林長春 130012）

1 前言

人干擾素α2b原液是用于配制人干擾素α2b類疫苗的中間產品，根據《中國藥典》（2020年版）三部，原液在制備過程中需采用有機溶劑乙腈作為純化過程的流動相，用以除去原液中的相關蛋白。根據《中國藥典》（2020年版）通則0861殘留溶劑測定法的要求，乙腈屬于第二類溶劑，應當限制使用，其限度為0.041%[1]。本文對此開展研究，以建立人干擾素α2b原液中乙腈殘留量的測定方法，并對該方法的系統適用性、重復性、準確性、中間精密度、檢測限和定量限進行驗證。

2 材料與儀器

2.1 材料

人干擾素α2b原液（長春生物制品研究所有限責任公司）；空白溶液（長春生物制品研究所有限責任公司）；乙腈標準品（純度：99.64%，批號：G1029269，Dr.Ehrenstorfer）；實驗用水為超純水。

2.2 儀器

氣相色譜儀（Agilent7890A型，配FID檢測器和Agilent7697A型頂空進樣器）；電子天平（XS205型，METTLER）；超純水儀（SynergyUV型，Millipore）。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HP-FFAP毛細管柱（25 m×0.320 mm，0.50 μm）；載氣：高純氮氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：60℃；檢測時間：10min；進樣口溫度：150℃；檢測器：FID；溫度：300℃；頂空進樣平衡溫度：70℃；平衡時間：20 min；分流比：10∶1。

3.2 標準溶液、供試品溶液、空白溶液的制備

3.2.1 0.000 4%標準溶液的制備

取乙腈標準品0.1 g，精密稱定，置于含50 mL超純水的100 mL量瓶中；加入超純水，稀釋至刻度，搖勻；量取0.4 mL上述溶液，置于含50 mL超純水的100 mL量瓶中；加入超純水，稀釋至刻度，搖勻，即得0.000 4%標準溶液。

精密量取0.000 4%標準溶液1 mL，置于10 mL頂空瓶中，壓蓋密封，作為標準溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

精密量取人干擾素α2b原液1 mL，置于10 mL頂空瓶中，壓蓋密封，作為供試品溶液。

3.2.3 空白溶液

精密量取空白溶液1 mL，置于10 mL頂空瓶中，壓蓋密封，作為空白溶液。

3.3 方法學考察

3.3.1 系統適用性試驗

按照3.1項色譜條件，分別對0.000 4%標準溶液、空白溶液及供試品溶液進行分析，記錄色譜圖。結果表明，空白溶液對被測組分無干擾；以乙腈色譜峰計算，理論板數≥5 000，分離度＞1.5，符合《中國藥典》（2020年版）通則0861殘留溶劑測定法中系統適用性試驗的要求，色譜圖見圖1。

圖1 標準品溶液（A）、空白溶液（B）及供試品溶液（C）的氣相色譜圖

3.3.2 重復性試驗

取同一供試品溶液，按照3.1項色譜條件進行分析，連續進樣6次，記錄色譜圖。按外標法計算乙腈的殘留量，結果顯示，平均殘留量為0.000 410 61%，RSD為2.31%（n=6）。表明該方法的重復性良好，測定結果見表1。

表1 重復性測定結果

3.3.3 中間精密度試驗

在不同時間，由不同檢測人員按照3.1項色譜條件，對同一供試品溶液進行分析，每位檢測人員分別檢測6次，記錄色譜圖。按外標法計算乙腈的殘留量，2位檢測人員的平均結果為0.000 398 4%，RSD為4.31%（n=12），測定結果見表2。

表2 中間精密度測定結果

3.3.4 回收率試驗

根據3∶7、5∶5、7∶3的比例，量取0.000 4%乙腈標準溶液及供試品溶液，混勻；分別量取上述溶液各1ml，置于10ml頂空瓶中，壓蓋密封；按照3.1項色譜條件，將每種比例的溶液連續進樣3次，記錄色譜圖。按外標法計算，乙腈的回收率在87.04%～101.98%之間，測定結果見表3。根據《中國藥典》2020年版通則9101分析方法驗證的指導原則，待測定成分含量為0.001%時，其回收率限度參考值為80%～115%，在基質復雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當放寬[1]。試驗結果表明，該方法準確度較高，符合《中國藥典》的規定。

表3 回收率測定結果

3.3.5 檢測限和定量限測定

取0.000 4%乙腈標準溶液，加入適量超純水，將標準溶液逐級稀釋；按照3.1項色譜條件進行測定，以信噪比約為3∶1時相應的濃度作為檢測限，以信噪比約為10：1時相應的濃度作為定量限。經測定，檢測限為0.000 004%，定量限為0.000 02%，測定結果見表4。

表4 檢測限及定量限測定結果

4 討論

4.1 頂空平衡溫度與平衡時間的選擇

根據《中國藥典》（2020年版）通則0861殘留溶劑測定法，以水為溶劑時，頂空瓶平衡溫度為70℃～85℃，頂空瓶平衡時間通常為30～60 min，結合所查閱的文獻[2-7]，本文選擇70℃作為頂空進樣的平衡溫度。在此溫度條件下，分別考察了平衡時間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min對測定結果的影響。結果表明，乙腈殘留量基本無變化，故本文最終選擇70℃作為頂空進樣平衡溫度，20 min作為頂空進樣平衡時間。

4.2 分流比的選擇

本文考察了不同分流比（5∶1、10∶1、20∶1）對試驗結果的影響，結果表明，乙腈殘留量基本無變化，故本試驗選擇10∶1作為分流比。

4.3 乙腈殘留量監測的意義

根據《中國藥典》（2020年版）通則0861殘留溶劑測定法的要求，乙腈作為第二類溶劑，應該限制使用，并將其限度定為0.041%。本文建立了簡便、快捷、準確的方法，可用于測定人干擾素α2b原液中乙腈的殘留量，能夠為人干擾素α2b原液的質量控制提供技術參考。