楊梅素對脫礦牙本質再礦化及樹脂-牙本質粘接效果的影響

王貝貝，韓 菲，袁曉君，陳 晨，謝海峰

黃酮類物質是一種多羥基類化合物，生物安全性高，作用范圍廣，具有較強的抗氧化、抗炎、抗菌和鎮痛作用，其中的特征性基團酚羥基(—OH)可以與生物大分子(如膠原的羥基、羧基、氨基和酰胺基)之間形成氫鍵而有效結合在一起，并促進膠原交聯，提高穩定性；還可以形成離子鍵和共價鍵，與金屬陽離子(如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+)發生螯合，這可能為促進牙本質膠原再礦化提供了必要條件[1-5]。楊梅素(myricetin，MYR)是天然黃酮類化合物中的一種，有學者發現MYR與成牙本質細胞樣細胞之間具有良好的生物相容性，還可介導牙本質膠原交聯，在臨床環境中有效地穩定樹脂-牙本質混合層，降低深層裸露的膠原纖維被降解的風險[6-7]。MYR是否對脫礦的牙本質具有再礦化活性尚未見研究報道，本研究通過評價MYR對脫礦牙本質基質的再礦化效果及其對牙本質粘接強度的影響，為臨床應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

經南京醫科大學倫理委員會批準(倫理號PJ2022-076-001)，于2021年7月—8月在口腔頜面外科門診收集新鮮拔除、無齲壞的第三磨牙，并保存在0.01%疊氮化鈉溶液中。流動水冷卻下用低速金剛砂切割機(Isomet 1000，Buehler，美國)獲取1 mm厚的中層牙本質，后用高速手機制備大小為5 mm×7 mm的牙本質樣本，使用牙科顯微鏡(OMS2350，Zumax，中國)仔細檢查所有牙本質表面，以確保沒有殘留的牙釉質或牙髓。每個樣本表面用600目碳化硅砂紙濕拋光30 s，形成標準的玷污層。

1.2 溶液配制

再礦化溶液(SBF)按照Chen等[8]的方法制備，將含鈣溶液和含磷溶液混合，其中含鈣溶液包括20 mmol/L CaCl2、18 g/L NaCl、14 g/L Tris和700 μg/mL PAA；含磷溶液包括12 mmol/L Na2HPO4，上述產品均來自中國麥克林公司。將新鮮配制的SBF溶液放置4 ℃保存備用，保存時間<1個月。

MYR溶液配制：將MYR(麥克林，中國)溶于無水乙醇中，制備成600 μmol/L的MYR溶液。

1.3 分組處理

根據有無MYR預處理和再礦化處理將樣本分為空白對照組(CON組)、陰性對照組(POS組)和實驗組(MYR組)。①CON組：35%的磷酸凝膠(格魯瑪，德國)酸蝕樣本15 s，部分脫礦后浸泡在蒸餾水中2 d；②POS組：35%的磷酸凝膠酸蝕樣本15 s，去離子水預處理30 min后進行再礦化處理，即將樣本在SBF中培養2 d，放置在37 ℃、100 r/min搖床上，每天更換SBF；③MYR組：35%的磷酸凝膠酸蝕樣本15 s，MRY溶液預處理30 min，再礦化處理同POS組。

1.4 形態學觀察及化學表征

各組中隨機選取5個樣本進行掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析，選取表面形態較好的樣本提交X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)分析。

將各組樣本在流動水下徹底沖洗干凈以去除表面未結合的物質，空氣中充分干燥后在SEM(MAIA3 TESCAN，捷克)下觀察，參數如下：預先噴鉑金，背散射電子模式，20 kV加速電壓，工作距離約5 mm。

XRD檢測樣本在射線衍射儀(D8 ADVANCE，Bruker AXS，德國)上進行，工作電壓為40 kV，電流為200 mA。在室溫下使用Ni過濾的CuK(λ=1.541 8?)輻照，步長=0.02°，描速速率為1°/min，掃描范圍2θ=20°～60°，記錄實驗結果。

ATR-FTIR檢測樣本采用配有鉆石晶體衰減全反應附件的分光光度計(Nicolet 5700FTIR，Nicolet，美國)，光譜采集范圍為800～1 800 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次，獲得的光譜使用Origin 2021軟件對其進行平滑、基線校正和歸一化處理。

1.5 納米滲漏實驗

將處理后的各組樣本按產品說明將粘接劑(Single Bond 2，3M ESPE，美國)涂布在表面，光固化燈下固化10 s，然后將復合樹脂(3M ESPE，美國)分兩層堆置到涂布粘接劑的牙本質表面上，每層2 mm，牢固壓實并光固化40 s，獲得樹脂-牙本質粘接樣本。將每組樹脂-牙本質粘接樣本在37 ℃的蒸餾水中保存24 h。使用低速切割機垂直粘接界面切取橫截面為1.0 mm×1.3 mm的粘接試件。各組中隨機選取3個柱狀試件在質量分數為50%的銀氨溶液中避光放置24 h后，將試件取出用流動水洗凈，置于顯影液中，在熒光燈下照射8 h，結束后試件再次用流動水沖洗。依次使用1 200、1 500、2 000、2 500、3 000目碳化硅砂紙進行打磨拋光。在使用一種目數砂紙拋光后，超聲清洗15 min。拋光結束后，試件常規干燥24 h后噴金處理。SEM在20 kV的加速電壓下以背散射模式進行觀察。

1.6 微拉伸強度(micro tensile strength，μTBS)檢測

按照1.5中的方法制備獲得樹脂-牙本質粘接樣本，在樣本中心部位使用低速切割機切割獲得橫截面為1 mm×1 mm的粘接試件，在萬能試驗機(Instron 3365 ElectroPuls，Instron，美國)上進行μTBS測試。粘接試件以1 mm/min的速度進行拉伸直至試件斷裂，記錄最大載荷。μTBS值=試件斷裂時的最大載荷÷粘接面積。

1.7 統計學分析

計算各組平均值±標準差，利用SPSS 21.0軟件對μTBS進行單因素方差分析，P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SEM形態學觀察

CON組牙本質表面的牙本質小管保持完全開放狀態，牙本質小管側壁上膠原纖維形態暴露，甚至出現膠原纖維間縫隙；POS組牙本質小管管腔內及管壁膠原纖維周圍有少量晶體形成，膠原形態變模糊，而MYR組牙本質小管內晶體沉積量進一步增加，膠原纖維被礦物質完全包裹，無明顯間隙出現(圖1)。

2.2 XRD和ATR-FTIR分析

各組樣本XRD結果如圖2所示，在2θ=25.90°、2θ=31.85°、2θ=32.28°和2θ=32.92°處有羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的典型衍射峰，分別為(002)，(211)，(112)和(300)衍射峰。

CON組牙本質的(002)反射衍射強度與(211)反射衍射強度的比值為0.295，POS組和MYR組該值依次增大(0.363和0.424)，這表明HA的取向是沿c軸的。

2.3 納米滲漏

各組樹脂-牙本質界面的典型納米滲漏圖如圖4所示。CON組混合層中有范圍較廣、密集且連續的銀離子沉積； POS組納米銀顆粒沉積的范圍減小且不連續；而MYR組混合層中顆粒沉積顯著下降，表現為少量分散沉積。

2.4 μTBS檢測結果

CON組、POS組和MYR組的μTBS值分別為(29.25±3.63)MPa、(36.65±3.16)MPa和(47.87±4.68)MPa，各組之間差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

本實驗使用全酸蝕系統對牙本質進行表層脫礦處理，研究了MYR作為牙本質膠原交聯劑，是否可以通過非經典再礦化過程——聚合物誘導液體前體(polymer-induced liquid precursor，PILP)的方法促進礦物質重新沉積在裸露的膠原纖維周圍，進而改善樹脂-牙本質粘接強度。PILP是目前公認的脫礦牙本質基質發生仿生再礦化的方法，與傳統的由上至下的再礦化理論不同，PILP是一種由下而上的非經典再礦化方法，是納米級無定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)顆粒滲透至脫礦牙本質深層，并自發沉積至膠原纖維內和膠原纖維間，而非依附于種子晶體的再礦化過程[9-12]。據報道， 膠原纖維和殘留的HA晶種雖有助于吸收鈣離子和磷離子，但再礦化發生的速度較慢，4周后，表面也只有少量的礦物沉積[13]。因此采取加快再礦化進程的措施是極其重要的。

基于Baldion等[6]對MYR的研究，本實驗選用了600 μmol/L作為MYR實驗濃度，在此濃度下，MYR可以維持成牙本質細胞的活性，并可達到與其他基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制劑(如原花青素和乙二胺四乙酸)相似的抑制作用，穩定膠原，在一定程度上改善樹脂-牙本質粘接強度，但對脫礦牙本質基質再礦化有何作用，目前尚不可知。

本研究觀察到MYR預處理后，脫礦牙本質再礦化有更多的HA形成，說明MYR對再礦化有促進作用。MYR是含有多個—OH的單分子化合物，可滿足與牙本質膠原纖維發生結合的同時利用游離—OH吸引礦化液中的鈣離子，加速礦物質形成，使深層裸露的牙本質膠原纖維得以在較短的時間內重新被無機物包裹，膠原纖維間縫隙減少[6，14]，與本實驗結果相似。

納米滲漏結果顯示再礦化處理后的樣本納米滲漏量有所減少，使用MYR預處理后可進一步減少。納米滲漏量的下降意味著混合層膠原纖維周圍水分子質量的減少，而水分子是直接導致或通過激活MMPs間接導致膠原降解并破壞樹脂-牙本質粘接效果的“催化劑”[15-16]。ACP顆?？梢詽B透至膠原纖維內部和膠原纖維間并在滲透差的作用下置換出水分子[17]，而MYR則以氫鍵結合的方式代替膠原纖維上或周圍的結合水或游離水，并由于本身的疏水性能避免了水的滲入，形成一道膠原纖維的保護屏障[6]。

為了進一步觀察MYR對樹脂-牙本質粘接性能的影響，本實驗進行了μTBS測試實驗。結果表明，再礦化處理有提高樹脂-牙本質的粘接強度的作用，而MYR溶液預處理則可以進一步增強。有研究發現導致樹脂-牙本質粘接失敗的原因主要是混合層的破壞?；旌蠈由顚拥哪z原纖維無法被樹脂單體完全包裹而裸露，其機械性能較差，且易受到水和MMPs的攻擊[16，18]。本研究中，MYR預處理后脫礦樣本再礦化膠原纖維被礦物質完全包裹，無明顯間隙出現，MYR通過促進礦物質對裸露膠原纖維的沉積包裹而產生保護作用，增加了混合層的機械強度，提高了μTBS值，明顯改善了樹脂-牙本質的粘接效果。

此外，本實驗中MYR溶液采用的溶劑是無水乙醇，有學者發現無水乙醇可逐步脫水和產生水置換，減少膠原基質中的水分子，從而保護膠原，這和MYR的結合及ACP顆粒的沉積有協同作用[19]。

綜上，MYR可有效促進混合層牙本質膠原纖維再礦化的發生并改善樹脂-牙本質的粘接強度。