褪黑素與內源生物鐘介導的哺乳動物季節性繁殖機理研究進展

趙淑琴，韓亞軒，魯巨貴，楊 榛

（1.甘肅農業大學基礎實驗教學中心，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省蘭州市紅古區農業農村局，甘肅蘭州 730070）

在以往的生產生活中，特定物種的繁殖季節按照長期規律來看都是恒定不變的，雄性動物精子最大活躍期和雌性動物的排卵期都是在每年相對固定的時間開始和結束的，這種年度節律是通過復雜的調控機制進行調控[1]。季節性繁殖除受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）的調控，還受內源生物鐘調控。哺乳動物通過視網膜感知光周期的穩定變化，將信號傳遞給下丘腦，此時一條途徑是位于下丘腦的視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）對光信號作出整合，引起SCN 上生物鐘基因的表達發生變化，然后SCN 將此信號傳遞給外周生物鐘，引起繁殖相關的基因節律性表達，最終使動物生殖激素發生變化，調控動物的季節性繁殖；另一條途徑則是光周期信號作用于松果體，導致松果體節律性分泌褪黑素（Melatonin，Mel），褪黑素又參與HPGA 的調控，使生殖激素的分泌發生節律性變化，最終共同調控動物的季節性繁殖[2]。本文通過綜述褪黑素、褪黑素信號通路以及生物鐘基因在季節性繁殖動物調控中的作用機制，以及褪黑素-褪黑素受體信號通路與生物鐘基因之間的直接交互作用和間接交互作用，一方面有助于在分子水平上將信號通路與晝夜節律生物鐘聯系起來，另一方面可以為完善哺乳動物體內生物鐘網絡的調控機制，為研究季節性繁殖動物的調控機制提供基礎。

1 褪黑素對季節性繁殖動物的作用機制

1.1 褪黑素通過HPGA 對生殖的調控 褪黑素是一種吲哚類激素，它是由哺乳動物和人體內的松果體分泌，化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytrypto mine）[3]。褪黑素的合成和分泌受光的抑制，在夜間激活，呈現夜增晝低的趨勢。褪黑素通過與膜相關的G 蛋白偶聯受體結合發揮作用，在人類和哺乳動物中褪黑素受體有MT1 和MT2 受體[3-4]。

松果體是褪黑素合成的主要場所，是所有哺乳動物感應季節性變化的關鍵。褪黑素的合成途徑是：當光信號通過刺激視網膜，將神經沖動傳遞給SCN，再通過腎上腺素能神經作用于松果體腎上腺素能受體，激活細胞內第二信使。其中，第二信使cAMP 和Ca2+誘導激活褪黑素合成的限速酶5-羥基-N-乙酰轉移酶（AANAT），使5-羥色胺轉變為N-乙酰-5-羥色胺，最后生成褪黑素[5]（圖1）。如果將松果體切除，會導致季節性繁殖行為不能隨著季節變化而同步變化[6]。其調控機理是當切除松果體后，對光信號不能做出應答，導致褪黑素無法合成，就失去了褪黑素對 HPGA 和生殖的調控，最終使季節性繁殖行為不能隨著季節變化而同步變化。

圖1 光照信號通過視網膜-松果體途徑對褪黑素的調控

褪黑素通過HPGA 對生殖的調控有直接和間接2種方式（圖2）。直接調節是指褪黑素直接作用于性腺，調控生殖激素的分泌，影響動物繁殖[7]。研究發現，褪黑素可以改變睪丸生精細胞、黃體細胞和卵泡顆粒細胞的形態，保護正在黃體化的顆粒細胞免受卵泡中活性氧的影響，在排卵期間促進黃體生成以產生黃體酮[8-9]。有文獻報道在馬精液冷凍稀釋液中加入1mmol/L 褪黑素可保護精子，提高凍精的受孕率[10]。在褪黑素的存在下，睪丸支持細胞可以顯著增強睪丸間質細胞雄激素的合成，褪黑素可以調節間質和支持細胞的分泌功能[11]。間接方式是指褪黑素通過作用于HPGA，影響促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）的分泌來調控動物生殖[12]。GTH 根據功能分為促黃體素（LH）和促卵泡激素（FSH），FSH 的主要功能是參與固醇類的合成及精子和卵子的產生，研究發現褪黑素作用于性腺軸使血漿中FSH、LH 水平降低，間接抑制了靶性腺激素的分泌[13]。LH 主要是影響排卵和排精，有文獻報道褪黑激素顯著降低了LH 和雌二醇（17β-estradiol，E2）的血漿水平，在排卵過程中部分抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，并誘導卵巢、輸卵管和子宮內雌激素受體、孕激素受體、雄激素受體的差異調節[14]。E2和睪酮（Testosterone，T）是生殖過程中最主要的類固醇激素，FSH 和LH 通過血液循環作用于性腺，與相應的受體結合后促進配子發生和類固醇激素合成[12]。有文獻報道，當褪黑素分泌量濃度較高時，會形成視網膜-SCN-松果體的神經內分泌反饋調節系統，反過來抑制視交叉上核對松果體的刺激作用，直接影響生物鐘機制[13]。

圖2 褪黑素對HPG 軸的調節

除此以外，褪黑素、促甲狀腺激素（TSH）參與SCN 與下丘腦垂體軸之間的聯系。垂體結節部（PT）存在大量的褪黑素受體，是調控繁殖的首要作用點，褪黑素在此調節TSH 的分泌[15]。因此，當大腦深處的光感受器感知并將光信息傳遞到PT，產生TSH。這種PTTSH 通過誘導下丘腦脫碘酶的產生使甲狀腺激素（T3）生物活性水平升高，而升高的T3 反過來抑制促性腺激素釋放激素分泌，以此介導HPGA 的季節性變化[16]。

褪黑素作為調節繁殖季節的重要激素，這一點己經在對馬、倉鼠等長日照動物和綿羊等短日照動物的研究中獲得了證明。根據動物種類、年齡、性別等不同，褪黑素對生殖系統的影響會表現出促進、抑制、無作用等結果。如褪黑素對牛、鼠類、禽類等動物起抑制生殖的作用，對綿羊和鹿等起促進作用，對光不敏感動物則表現為無作用[7,17-18]。褪黑素的分泌與接受的光照成反比，在光照強度比較低的黃昏和拂曉時褪黑素的釋放被完全抑制[19]。對于長日照動物而言，褪黑素分泌量增加導致GnRH 分泌減少，影響性腺功能；對于短日照動物，褪黑素信號會使得性腺功能活躍。補充外源性褪黑素使馬的睪酮濃度降低、小鼠睪丸退化[12,20]。另一方面，外源性褪黑素可以促進公羊體內LH 和FSH 分泌，能夠引起血清睪酮水平的較大日波動[21]。有文獻報道給切除松果體的公羊埋植褪黑素來模擬長日照褪黑素信號，實驗發現70 d 后公羊體內重建了LH 節律分泌模型。而短日照的褪黑素信號卻不能誘導LH 季節性節律分泌模式，可以得出羊的LH 的分泌是由長日照褪黑素信號調節的[22]。因此光照的信息支配著長日照和短日照動物的分類，同樣支配著褪黑素的節律性分泌，其相互之間也許是獨立的[18]。

1.2 褪黑素作用于性腺類固醇激素對生殖的調控 早期報道褪黑素可抑制雌激素等性腺類固醇合成，這是褪黑素和雌激素信號通路之間相互干擾的第一個跡象。隨后的研究表明褪黑素通過3 個關鍵機制影響雌激素的作用：①通過抑制性腺合成激素（包括雌激素）來降低其循環水平；②通過與ERα作為選擇性雌激素受體調節劑（SERM）的相互作用來改變雌激素結合、DNA 結合和轉錄活性；③通過抑制從膽固醇或其他類固醇中合成雌激素的關鍵酶如芳香化酶、硫酸鹽酶和醛酮還原酶（AKRs）的活性[17]。褪黑素對哺乳動物生殖生理的影響還不完全清楚，但褪黑素確實對卵巢顆粒細胞中的類固醇生成發揮了一些調節作用。研究證明褪黑素激活Gαi2 蛋白降低cAMP/PKA 水平，以及PKA 敏感部位ERα絲氨酸236（s236）的磷酸化，介導了褪黑素對ERα轉錄活性的抑制[23]。

Ahmad 等[24]在毛竹鼠睪丸內注射褪黑素，體外培養毛竹鼠睪丸間質細胞，發現細胞中類固醇激素的生成下降，睪酮水平降低，雄激素受體（AR）、雄激素結合蛋白（ABP）、3β-羥基固醇脫氫酶（3β-HSD）活性都有所降低。Valenti 等[25]報道了成年大鼠的睪丸間質細胞中存在褪黑素受體。Wu 等[26]研究小鼠睪丸間質腫瘤細胞時發現：單獨用人絨毛膜促性腺激素/環磷酸腺苷（hCG/cAMP）類似物處理細胞，睪酮水平升高、類固醇急性調節蛋白（StAR）表達升高；用hCG/cAMP類似物處理細胞并加入褪黑素發現，褪黑素在3 h內抑制細胞中睪酮產生、StAR 表達降低，StAR 蛋白的表達和類固醇的產生因褪黑激素濃度從1 nmol/L 到10 nmol/L 而降低，說明褪黑素通過阻斷StAR 蛋白表達、特異性結合位點抑制小鼠睪丸間質細胞類固醇生成。

2 生物鐘

2.1 生物鐘的組成 晝夜更替是地球自轉而產生，生物體為適應這種環境，在生物體內產生的呈周期性、穩定可持續的內源性生物現象為晝夜節律。晝夜節律使得生物體的各項生理活動呈現一定的時間周期變化，包括激素的分泌、睡眠與覺醒、新陳代謝與細胞分裂、血壓體溫等的周期性變化[27]。在生物體內，月節律、年節律、周節律都屬于節律系統。

生物鐘作為晝夜節律振蕩器的重要組成元件，幾乎在所有組織中都存在。主時鐘位于哺乳動物大腦區域的下丘腦視交叉上核（SCN），其他器官的生物鐘被稱為外周生物鐘。中樞時鐘系統由時鐘基因Period（Per1/2/3）、Crytochrome（Cry1/2）、Clock、Bmal1、CKIε、Rev-Erbα等和其編碼的蛋白，以及一些代謝相關基因組成。通過神經遞質、內分泌和體液等的傳導作用于外周時鐘系統，和外周時鐘系統共同組成生物鐘[28]。哺乳動物內源性的晝夜節律與環境保持同步，主要依賴于中樞時鐘系統與外周時鐘系統相互協調作用，晝夜節律也協調哺乳動物的生命活動和生理狀態的平衡有序。

生物節律形成的核心分子機制就是生物鐘構成的轉錄-翻譯反饋環路。時鐘蛋白Clock 和Bmal1 形成異二聚體，它們識別并結合到E-box（CACGTG）上，E-box是下游鐘控基因的啟動子。于是靶基因的轉錄被激活，翻譯出新的蛋白質，調控機體的節律。白天Bmal1-Clock 異二聚體作為反饋環中的核心調節因子，使細胞核內Per、Cry或其他基因的轉錄活性增加，導致細胞質中Cry 和Per 的蛋白水平的升高。夜間這些蛋白通過核孔進入細胞核，并形成Cry-Per 復合物，識別并結合到Bmal1-Clock 異二聚體上，抑制了Bmal1-Clock 異二聚體的功能，導致Per、Cry基因的轉錄活性關閉，隨后Cry-Per 復合物被泛素化后降解。于是隨著Cry-Per復合物被蛋白酶體降解，解除了對Bmal1-Clock 異二聚體的抑制，這樣新一輪的轉錄又將開始[29]。如此就形成了一個轉錄-翻譯負反饋環（圖3）。

圖3 主時鐘轉錄-翻譯反饋環的的調節模式[30]

與外周生物鐘不同，SCN 主鐘對于生物體生物鐘節律至關重要，一旦SCN 主鐘遭到損壞，整個生物個體生物鐘節律可能直接喪失。Ralph[31]以松鼠猴為實驗對象得出以下結論，當松鼠猴的SCN 被破壞后，它的節律性行為及內分泌消失，當重新移植SCN 后，松鼠猴的節律性行為又得以恢復。SCN 主鐘的生物鐘節律表現非常穩定，尤其是與外周生物鐘相比較而言。

2.2 生物鐘對季節性繁殖動物的作用機制 SCN 核團作為中央生物鐘，是通過一種偶聯同步化機制來確保有機體的各項機能維持穩定，血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）神經肽就是一個起到重要作用的神經遞質。SCN 通過產生VIP 和精氨酸加壓素（AVP）2 種神經肽，將生物鐘信號傳至卵巢、睪丸等外周組織。VIP 也可直接刺激下丘腦的GnRH 神經元活動，影響GnRH 的分泌，并且能間接作用于RF 酰胺相關肽（抑制GTH 的釋放）神經元活動，抑制其對GnRH 神經元的作用，從而參與HPGA 的調控[32]。Hughes 等[33]研究發現，將小鼠VIP基因或是VIP 受體基因（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 2，VIPR2）敲除后，小鼠的日常行為及生理水平的生物鐘節律都受到了很大的破壞和影響，盡管基因敲除小鼠的生物鐘負反饋環路在細胞水平上的是完整的，同時其生物鐘在細胞水平上的運行也是正常的，但是對于小鼠機體生物鐘的破壞是存在的。

受節律生物鐘的調控，雌激素、睪酮、褪黑素、糖皮質激素等的分泌通常呈現一種周期性規律。在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等生殖系統惡性腫瘤中發現，性激素分泌的晝夜節律發生變化，晝夜節律紊亂導致乳腺癌發病率增高[19]。很多研究數據顯示，生物鐘與雌二醇-雌二醇受體（E2-ERa）信號通路間存在關聯，并且E2-ERa 信號通路參與了生物鐘基因的轉錄過程[34]。Rossetti 等[35]研究發現，E2 使生物鐘基因Bmal1表達上調，其相互作用在乳腺導管的發育過程中產生重要作用，在人乳腺細胞系中敲低ERa，并加入E2 發現，Per2和Bmal1的轉錄下調，雌二醇受體以雌二醇依賴的方式調控Per2-Bmal1 時鐘機制。在E2-ERa 信號通路的下游存在生物鐘基因Per2，Per2的啟動子上存在雌激素反應元件（ERE），ERa 結合在ERE 上促使Per2的轉錄，使細胞質內Per2 蛋白含量升高；升高的Per2 蛋白反過來抑制ERa 與ERE 結合，使乳腺腫瘤細胞增殖受到抑制，研究發現，具有家族原發性乳腺癌患者的乳腺組織，生物鐘基因Per1和Per2的表達顯著低于正常人群的乳腺組織[36]。另有文獻報道，體外培養大鼠的子宮上皮細胞加入E2 后Per1基因高表達[37]。這進一步表明了E2 與生物鐘存在關聯。

3 褪黑素信號通路與生物鐘交互作用

3.1 褪黑素與生物鐘基因在中樞途徑中的交互作用 褪黑素對于大多數生物體來說，其最主要的功能就是為生物體提供時間信息。松果體和視網膜產生的褪黑素晝夜變化規律從魚類到哺乳動物都是非常恒定的，褪黑素波峰都出現在夜晚。褪黑素合成酶（AANAT）是褪黑素合成的限速酶，該酶活性和褪黑素的水平具有同步性。生物鐘可以調節AANAT 活性，AANAT 活性在也受到光照條件的抑制[38]。研究發現，Bmal1-Clock 異二聚體能夠作用于AANAT基因啟動子的E-box 元件上，增強了AANAT基因的轉錄，促進了褪黑素的合成，這樣使得AANAT的表達和褪黑素的濃度也表現為晝夜節律性，即夜間表達較高；而在白天，由于Bmal1-Clock 異二聚體受到Cry 蛋白的抑制，AANAT基因的轉錄也受到抑制，使AANAT表達較低，褪黑素的合成也隨之減少，在白天出現表達較低的現象[39]。

Yamanaka 等[40]研究發現，給與小鼠5d 的全黑暗條件，垂體細胞中Clock基因表達升高，Per1/2及Bmal1基因表達降低；用褪黑素注射處理后，Clock基因表達水平降低，Per1/2的表達水平升高，Bmal1沒變化，推測褪黑素、褪黑素合成酶及生物鐘基因之間存在反饋作用環路。還有實驗表明，生物鐘Cry基因是感光基因，且是AANAT 轉錄的阻遏物，在Cry1和Cry2雙缺陷小鼠（Cry1-/-/ Cry2-/-）中褪黑素含量很低，將Cry1-/-/ Cry2-/-小鼠持續一段黑暗時間的處理后，其生物鐘節律丟失，AANAT和時鐘基因Per1的表達水平很高[41]。還有研究表明，較長光照時間的刺激，能夠引發Per2基因的高表達，而Per2基因的高表達會抑制AANAT表達，因而推測Per2基因的表達與褪黑素的合成具有相反的模式[42]。當敲除小鼠松果體細胞中的褪黑素受體MT1時，小鼠垂體細胞中Per1、Cry1、Clock和Bmal1基因的表達顯著降低，說明生物鐘基因節律性表達與褪黑素受體的存在有著密切關系[43]。

本實驗室團隊在前期以季節性繁殖動物雙峰駝卵巢顆粒細胞為模型，研究其生殖調控過程中發現，通過免疫定位實驗顯示MT1 和MT2 受體蛋白主要存在于細胞膜和細胞質中，Cry1 和Cry2 蛋白主要存在于細胞核和細胞質中；當過表達基因MT1/2后，Cry1/2基因的表達顯著增加，可通過cAMP/PKA/CREB 通路解釋清楚；但是當過表達Cry1/2后，MT1/2基因的表達也顯著增加，推測Cry基因對MT1/2的調控發生在轉錄水平，暗示MT1/2的啟動子中含有Cry基因的結合元件[44]。

3.2 褪黑素與生物鐘基因在外周途徑中的交互作用 褪黑素作為中樞生物鐘的輸出和外周振蕩器的輸入，在調節中起著重要作用。關于褪黑素的生物作用已經被報道過很多，但最好的描述是它作為一種神經激素和光/暗周期的牽引劑，以及SCN 外周時鐘的同步器的生物鐘作用[9]。夜間血液中褪黑素水平升高，會通知身體細胞和器官現在是夜間，并幫助組織目標器官和器官系統進入適當的體內平衡代謝節奏，白晝長度或光照時間/相位的改變都會使SCN 活動及伴隨的松果體產生褪黑素的活動不同步[18]。

LH 作為調控生殖的重要激素，在哺乳動物的排卵、性激素的分泌過程中發揮重要作用。有文獻報道，褪黑素對LH 有直接調節作用，其關鍵作用是影響前列腺素合成酶（又稱環氧合酶，Cyclooxygenase2，COX2)，COX2 也是影響排卵的重要因素，COX2啟動子中存在E-box 序列，Bmal1-Clock 異二聚體可與E-box 序列結合調控COX2的表達，當敲除卵巢顆粒細胞中的Bmal1基因，COX2表達和前列腺素合成顯著降低[45]。這表明前列腺素使卵泡破裂的調控機制依賴于卵巢上的生物鐘的調控。

Ding 等[46]研究還發現，褪黑素可以間接影響睪酮水平，睪丸內睪酮的合成需要一系列睪丸合成酶(P450scc、P450c17、3β-HSD、17β-HSD) 的作用形成，睪丸內存在Bmal1基因，該基因可誘導睪丸合成酶合成。Chung 等[47]研究發現，類固醇急性調節基因（StAR）的轉錄可以直接被Bmal1基因激活；當敲除小鼠Bmal1基因時，StAR基因表達顯著降低，睪酮水平也隨之降低，可以看出，Bmal1基因在調控哺乳動物分泌睪酮時起到關鍵作用。另外，當切除小鼠的松果體后，睪酮和Bmal1、StAR、Rev-erbα的表達均發生顯著變化，當注射褪黑素后各項參數得到恢復[48]。因此可以得出，褪黑素可通過調控鐘基因Bmal1的表達來影響睪酮生成。在敘利亞倉鼠中，給與正常的光照節律，其Bmal1基因的表達無明顯節律，而Per1基因存在節律性，其在夜間的表達水平最高；將倉鼠長時間置于黑暗環境時，其褪黑素分泌的節律性消失，倉鼠性腺衰退，而此時Bmal1基因的表達則表現出明顯的節律性，Per1基因的節律性消失[49]，說明褪黑素和生物鐘基因都受光暗條件的限制，相互依存、相互影響。

AANAT、HIOMT、MT1、MT2基因是褪黑素合成和發揮作用的關鍵。文獻報道，在大鼠的卵丘-卵母細胞復合體（COC）中存在上述基因，同時，還存在Clock、Bmal1、Cry1/2、Per1/2等生物鐘基因，在排卵后輸卵管壺腹部獲得的成熟COC 上的Bmal1基因表達水平較高，其他基因在卵巢組織中分離的未成熟COC上的表達水平較高；切除松果體后，COC 中AANAT、HIOMT、MT1、MT2等基因的表達水平發生變化；注射褪黑素后，上述基因的表達恢復生物鐘節律[50]。上述實驗結果表明，褪黑素通過影響COC 進而影響生物鐘基因的表達，對卵巢功能具有調控作用。

Steven 等[19]研究表明，MT1 蛋白和MT2 蛋白形成的異二聚體抑制cAMP 的積累，與cAMP 相關的信號通路受到調控，使生物鐘基因表達發生改變。本實驗室前期研究發現，Cry 蛋白主要存在于卵巢顆粒細胞的細胞核中，卵巢顆粒細胞上存在褪黑素受體基因（MT1、MT2）和節律基因（Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3）的表達；過表達MT1/2基因后，cAMP 產生受到抑制，除Cry1/2表達極顯著升高外，其他基因（GNB2、PKA、CREB、Per1/2/3、Clock）均極顯著降低[44]。過表達Cry1/2后，cAMP 的產生受到抑制，除MT1/2的表達極顯著升高外，其他基因均顯著降低[44]。MT與Cry通過cAMP/ PKA/ CREB 通路構成一個環路（圖4）。此結果解釋為，當過表達MT1/2基因，cAMP 產生受到抑制，使有活性的PKA 生成降低，進一步影響CREB 的磷酸化，使得Per的轉錄受到抑制，負反饋調節因子Cry 激活，其表達含量升高。該結果與核心節律的生物鐘調控機制完全一致。為進一步驗證基因的相關性，當過表達基因Cry后檢測相關信號通路基因的變化，結果顯示與過表達MT的結果完全一致。有2 種分析途徑，一是過表達的Cry抑制了cAMP，進而影響cAMP/PKA/ CREB 信號通路，使結果與過表達MT完全一致，二是暗示了MT和Cry之間存在的聯系發生在轉錄水平。

圖4 cAMP/PKA/CREB 信號通路介導的褪黑素對生物鐘基因的作用機制[44]

4 總結與展望

生物鐘基因受光照控制，其分子機制根據轉錄-翻譯負反饋環路進行振蕩，控制生物體的各項節律性生理活動和行為。本文總結了有節律的褪黑素合成不但通過HPGA 通路調控哺乳動物的季節性繁殖，還通過下丘腦甲狀腺激素-GnRH 調控動物的繁殖。位于SCN 的主生物鐘通過感光基因表達的變化引起生物鐘基因的節律性振蕩，之后將這種振蕩傳遞給外周生物鐘，使性激素合成相關基因的表達發生變化，進而調控生殖。本文分別從生物鐘基因對生殖的調控，及褪黑素介導的生物鐘基因對生殖的調控，從中樞途徑和外周途徑兩方面入手闡述其相互作用關系，為完善褪黑素、生物鐘作用的季節性繁殖規律提供更具體的思路，是控制動物季節性繁殖行為的重要內容。

動物利用光周期的變化來適應即將到來的繁殖季節，這對于深入理解動物季節性繁殖的機制有幫助。雖然人類不是季節性的，但人類有很多生物節律，如睡眠-覺醒節律、青春期發育等。生物節律的紊亂導致體內激素水平異常，與乳腺癌、甲狀腺疾病有很大的聯系，因此了解動物季節性繁殖的分子機制有助于更好地理解人類的生物節律。盡管人們已經非常了解褪黑素的合成途徑，但是，褪黑素驅動節律本身的機制，以及與生物鐘分子機制中存在的千絲萬縷關系還是未知的，褪黑素受體基因啟動子中是否含有誘使或者結合生物鐘基因轉錄的核心位點還需要進一步驗證，這也是本實驗室的下一步計劃。