牛XY 染色體差異分析及特異性基因的精準定位

史佩華，陶晨雨

（河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000）

性別鑒定在畜禽動物生產中有著重要的意義，因此對于性染色體及特異基因的分析十分必要。性染色體由一對獲得性別決定基因的祖先常染色體進化而來，在結構和基因含量上存在差異[1]。人類Y 染色體上男性特有序列MSY 占Y 染色體序列的95%，全長23 Mb，包含短臂（Yp）的8Mb 和長臂（Yq）的14.50 Mb。在MSY 中存在1 個著絲粒異染色質區域（約1Mb）和一個跨度約400 kb 的異染色質區[2]。人類的PAR1 和PAR2 位于性染色體長臂的頂端[3]。像人類一樣，PAR和性別決定基因（SRY）位于黑猩猩的長臂末端，但是在大猩猩Y 染色體中卻位于短臂末端[4-6]。在雌性哺乳動物中，X 染色體全長大約155 Mb，共有1 098 個基因（7.10 Mb），在X 染色體上基因密度較低，同時基因長度也較短[7]。但是X 染色體上包含人類基因組中已知的一個特異性基因PLP1與性連鎖遺傳相關。PLP1是位于X 染色體的高度保守的編碼髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）基因，構成中樞神經系統髓鞘的主要蛋白質[8]。Y 染色體較短但卻攜帶著較多的功能基因，其中SRY[9-10]是研究最多的基因之一。SRY基因位于Y 染色體短臂（Yp）上，是目前公認的睪丸決定因子，在哺乳動物的性別決定中至關重要。

牛肉產業從雄性動物的生產中受益，而乳制品產業從雌性動物的牛奶生產中受益。因此需要具有理想性別的動物促進生產。雖然目前有對牛的Y 染色體基因進行定位和功能分析的相關研究[11]，但是由于測序技術的限制，測得的片段很難區分X 與Y 染色體，無法從短序列讀取復雜且高度重復的Y 擴增子區域，Y 染色體相關數據有限。因此，對牛性染色體的了解仍然不夠全面。本實驗根據已有的牛參考基因組對牛的性染色體序列做了系統的基因組生物信息學分析，選擇特異性基因PLP1和SRY進行精準定位，為研究牛性染色體提供理論支撐，有助于推進后續的性別鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 參考基因組下載和XY 染色體序列比對分析 本文中牛的最新參考基因組（assembly ARS-USD 1.2）下載于NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）。在下載的參考基因組文件中，保留了完整的XY 染色體序列信息。通過序列相似性BLAST 比對，對牛X 染色體和Y 染色體比對分析，找到牛X 染色體和Y 染色體的基因富集區域。

1.2 XY 染色體特有基因GO 分析 在Ensembl 數據庫（http://www.ensembl.org/biomart/martview）下載牛的XY 染色體特有基因ID 及GO 功能注釋信息（LU_Bosgru_v3.0），在Omicshare 云平臺（https://www.omicshare.com/tools）進行GO 二級分類。分析X 染色體特有基因PLP1和Y 染色體特有基因SRY的GO 二級功能注釋結果。

1.3PLP1、SRY基因結構分析 將X 染色體上基因密度最高的前15 個區域和Y 染色體上基因密度最高的前10 個區域定義為熱點區域。R 語言包“Rideogram”繪制染色體基因密度圖[12]。R 語言包“Sushi”顯示靶基因PLP1和SRY的結構[13]。

2 結果

2.1 XY 染色體基因組特征 基于牛XY 染色體基因密度分析，本研究獲得了XY 染色體上的基因富集區域，整個X 和Y 染色體分別在圖的左側和右側使用相同的比例顯示。圖譜上的基因密度信息映射為熱圖中的重疊特征，并在圖譜旁邊添加軌道標簽，三角形標記為熱點區域（圖1）。但是在X 染色體上存在部分區域基因缺失，尤其在末端有大量空白區域，Y 染色體只有末端區域存在部分基因缺失。Y 染色體基因密度整體較高，X染色體基因密度比較低。說明XY 染色體上基因分布不均勻，X 染色體區域上基因含量較少，Y 染色體上基因含量豐富。其中X 染色體上包含130 個特有基因區域，而Y 染色體上包含42 個特有基因區域，XY 染色體上前10 個高密度基因區域如表1 所示。

表1 XY 染色體基因富集的前10 位熱點區域

圖1 XY 染色體的長度和基因密度

2.2 XY 染色體特異基因GO 分析 把XY 染色體特有基因進行GO 二級分類，注釋繪制成圖表并進行結果篩選（圖2、表2）。雖然XY 染色體整體功能組差異不大，但是仍然存在一些功能特異性差異，比如在多細胞生物進程、應激反應、發育過程、分子功能調節、免疫過程中X 染色體比Y 染色體比例更高。甚至有關定位、運動方式、生殖過程、繁殖、生長、行為、規律性進程、細胞連接、超分子復合物、結構分子活性和轉錄因子活性以及蛋白質結合只注釋到X 染色體，但是電子載體活性只注釋到Y 染色體。另外X 染色體保守基因PLP1注釋到生物調節、單一生物體過程、新陳代謝過程、應激反應、細胞成分組織或生物生成、多細胞生物體過程、發育過程相關二級功能。Y 染色體保守基因SRY注釋到生物調節、單一生物體過程、多細胞生物體過程、發育過程、繁殖、生殖過程、細胞、細胞器、凝集、核酸結合轉錄因子活性相關二級功能，可見PLP1與SRY存在部分相同功能例如生物調節、單一生物體過程、多細胞生物體過程、發育過程。

圖2 性染色體GO 注釋的統計分類

XY 染色體特有基因被分成3 個功能組，包括生物過程、細胞組分、分子功能，X 染色體包括PLP1、MECP2、AR、ATRX、FOXO4、CASK、GATA1、HDAC6、FOXP3等特異基因共1 062 個（表3），多數基因的GO 二級功能主要富集在生物調節、代謝過程、應激反應、細胞器部分、大分子復合物、催化活性等（表2）。Y 染色體包括TLR7、ADGRG2、MSL3、PRPS2、GLRA2、PRKX、GPR143、ANOS1、SRY等特有基因共197 個（表3），多數基因的GO 二級功能主要富集在生物調節、單一生物過程、代謝過程、應激反應、組織或生物發生、細胞結合、催化活性、信號部分等（表2）。

表2 XY 染色體GO 注釋條目及基因數目

表3 XY 染色體部分特異性基因

2.3PLP1、SRY定位分析PLP1與SRY基因是廣泛研究的XY 染色體特異基因，在性別鑒定等領域有著廣泛應用，又因基因保守性較好，因此本研究挑選了PLP1與SRY2 個基因進行分析。分析得出PLP1基因定位在X 染色體上52.00～53.00 Mb 區域，基因含量比較高，具體介于52.40～52.60 Mb 之間，包含7 個外顯子，6 個內含子（圖3）。對SRY基因定位發現，SRY基因位于Y 染色體上42.00～43.00 Mb 極高密度區域，在42.20～42.40 Mb 之間有6 個外顯子、5 個內含子（圖4）?；虻膹椭瓶偸窃谔囟ㄎ恢瞄_始，許多基因疾病的發生由某個基因的突變與復制錯誤造成，進行基因定位將有助于為疾病的治療發現重要的靶點。PLP1與SRY是性別鑒定中的常見基因，可以為性別鑒定與疾病治療等技術提供理論基礎。

圖3 PLP1 在X 染色體上的定位分析

圖4 SRY 在Y 染色體上的定位

3 討 論

3.1 XY 染色體基因組特征分析 關于XY 染色體進化差異的學說經歷了多個時代，近幾十年來的基因組研究認為哺乳動物X 染色體在種間大小和結構上與常染色體相似，并保留了大部分祖先X 基因[2]。進化過程中XY 染色體片段增加擴展了PAR 區，因此X 染色體基因高度保守，基因豐富。哺乳動物的Y 染色體卻發生了實質性的進化差異，積累了雄性特有的基因和參與性別決定的基因，丟失了95% 的祖傳基因，Y 染色體與基因組的其他部分不同，它是雄性特有的并表現出獨特的結構和功能特征[14]。本研究通過對XY 染色體部分的個體基因研究表明X 染色體基因密度較Y 染色體來說要低得多，X 染色體中基因含量較高，但是基因密度不均勻，分布比較分散，部分末端明顯沒有基因分布，Y 染色體退化導致雖然基因含量不多卻分布比較集中。這與Y 染色體進化過程中具有基因譜系特異性而導致的基因含量比較保守的情況是一致的[15-17]。Y 染色體比X染色體小得多，是基因組中最小的染色體，主要由假常染色體（PAR）、X-簡并（X-D）和擴增子區域組成[2]。XY 染色體只在假常染色體區域PAR1 和PAR2 的末端發生重組，基因的大量重組導致序列測定很難進行[18]，單倍體對Y 染色體重復序列的影響最大。Y 染色體的大部分長度不受染色體配對要求的限制，這些重復序列通過染色體內重組促進頻繁的染色體重排，導致高度的結構變異[19-21]?；蛎芏刃畔⒖蓱糜诙喾N不同情況，如單核苷酸多態性（SNP）和候選標記、DNA 甲基化動力學、轉錄因子（TF）結合位點和候選靶基因[12]。除了在染色體水平上可視化整個基因組的一些特定基因組特征，Rideogram 還可以用于比較2 個相關的基因組特征，這將為更好地理解這2 個特征的染色體分布之間的相關性提供一些重要的啟示。本研究利用生物信息學分析技術對XY 染色體進行差異分析，結果獲得了可視化的性染色體上相關基因組特征。

3.2PLP1、SRY基因特征分析 XY 染色體不同于常染色體，它含有許多與性發育和生殖有關的偏向基因，特定的性染色體基因可以通過偏向性別的表達和在大腦中的功能導致發育中的性別差異，例如PLP1基因等[22]。本實驗結果顯示PLP1基因定位到牛的X 染色體內一個基因密度較高的區域，位置在52.4～52.6 Mb，具有7個外顯子。Chanchani 等[23]報道了人類的PLP1基因位于X 染色體長臂Xq22.2 q23 一個復雜的基因組區域，表明靈長類和牛的X 染色體的基因結構在進化過程中存在物種特異性。SRY定位到Y 染色體末端的假常染色體區域，具有6 個外顯子。但是在人的Y 染色體上SRY標記為單外顯子基因[24]，說明在進化的過程中Y染色體可能依賴基因譜系。最近的研究發現小鼠SRY的第2 外顯子和其相對應的SRY轉錄本（SRY-T）才是真正的睪丸決定因素[25]。有研究表明雖然SRY基因作為單拷貝基因存在于幾乎所有哺乳動物中，但大鼠攜帶6 個拷貝，而小鼠SRY基因由于存在長倒置重復序列而具有與其他哺乳動物SRY基因不同的結構[26]。類似的研究結果顯示SRY基因定位到Y 染色體的Yp 非常接近PAR1，Yp 上的PAR1 和Yq 上的PAR2 是Y 染色體中唯一在男性精子發生過程中與X 染色體同源序列進行減數分裂重組的區域，SRY與PAR1 的接近性使其容易在異常重組后易位到X 染色體[27]。當有XY 個體發生性別反轉時，SRY基因在DNA 結合域有嚴重的突變[28]。有研究用FISH 法將SRY定位到牛Y 染色體正常編碼區，但是表型特征卻顯示這頭母牛沒有發育睪丸，而是發育了有缺陷的卵巢[29]。事實上，SRY基因座的突變和缺失僅占 XY 的15%[30-31]。

3.3PLP1、SRY基因功能及應用分析 性別分化涉及一系列事件，其性腺和生殖器逐漸獲得男性或女性特征依賴于一個復雜的功能基因網絡，性染色體基因的正常功能保證了生物體發育的動態平衡。GO 分析結果顯示XY 染色體候選基因在發育與性別差異等功能中有性別偏向表達，許多X 連鎖基因在分子功能上與Y 連鎖基因有較大差異的表達。與本研究一致的基因表達分析也說明X 連鎖基因在大腦和其他組織中有很強的性別偏向性，往往偏向于女性[32]。

PLP1具有調節細胞成熟、炎癥反應、中樞神經系統髓鞘形成、基因上調等方面的功能，PLP1中的點突變和重復會導致X 連鎖的髓鞘障礙疾病，例如Pelizaeus-Merzbacher（PMD）病或2 型痙攣性截癱，PMD 病是一種罕見的X～連鎖腦白質營養不良癥，患者的臨床特征可能受到PLP1重復序列的影響[23]。該基因特異性表達于少突膠質細胞的髓鞘[33]。有研究表明PLP1基因在胚胎中樞神經系統中表達較早，早于少突膠質細胞的產生，采用遺傳學方法顯示胚胎表達PLP1的膠質祖細胞生成的出生后星形膠質細胞僅存在于脊髓腹側，在胚胎神經發育過程中PLP1的表達展現了細胞的動態特性[34]。女性常見的染色體疾病很可能與XY染色體特有的基因單倍體不足有關，例如特納綜合征（Turner syndrome）是具有SRY基因導致的混合型性腺發育不全和外部性別分化的疾病[35]。SRY基因的表達在不同的物種間有差異。在人體內SRY基因在生殖嵴中的一小部分細胞中表達并啟動睪丸的形成，人類SRY基因在性腺表達開始于妊娠后期，到成年仍有表達并見于其他組織[36]。與人類相似，在小鼠體內SRY基因僅在生殖嵴的中心區域低表達，但隨著性腺的發育，一旦生殖嵴發生性別分化，SRY基因表達量就開始減少。SRY基因在睪丸開始形成之前到結束的瞬時表達驗證了SRY基因啟動睪丸的發育但卻不維持睪丸的發育這一結論[37]。PLP1與SRY的定位與功能對于胚胎的生長及基因疾病有很大的指導意義。對牛早期胚胎進行性別鑒定和選擇可以極大提高養牛行業生產效益和經濟效益。通過檢測性染色體Y 上是否含有SRY基因來確定胚胎的性別是一種精確度高且靈敏的方法，準確率可達90% 以上，應用前景可觀[38]。Sherry[39]等人對來自妊娠3～6 周的82 個樣品的cfDNA 進行Y 染色體特異性序列SRY的實時熒光定量PCR 成功檢測出SRY 陰性為女胎，陽性為男胎。另有研究通過在患有X 連鎖隱性疾病的母體中檢測母體血漿中無細胞胎兒DNA 的Y染色體序列，在產前確定胎兒性別[40]。通過對植入前胚胎的性別預測來控制性別比，不僅有利于牲畜的管理、生產和育種計劃，而且有利于診斷產前階段的遺傳疾病。性別鑒定技術是有價值的生物技術，有可能徹底改變養牛業。隨著分子生物學和細胞生物學的發展，性別檢測策略將有助于改善臨床遺傳疾病。哺乳動物性染色體系統是高度保守的，性別決定是一個復雜的過程，受到各種內部和外部因素的影響[41]。進一步探索性別決定機制可以為畜牧業生產提供動力。

4 結 論

本研究通過對牛的性染色體進行生物信息學分析發現X 染色體特有基因高密度區域共15 個，Y 染色體上10 個特有基因高密度區域，并且對XY 染色體上較保守的基因PLP1和SRY進行了精準定位，結合GO 分析為解釋性別調控機制及候選基因的研究提供了基礎資料。

致謝：感謝所有作者對本研究的貢獻，感謝學校提供的平臺支持。