原花青素對吐魯番黑羊精液冷凍保存效果的研究

艾克拜爾·艾合麥提，宋玉坤，阿里木江·喀迪爾，努爾博·依熱木拜科，趙 茜，樊 琛，熱衣拉古麗·熱依木，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農業廣播電視學校沙雅縣分校，新疆沙雅 842200；3.徽商生態牧業有限公司，新疆吐魯番 838100）

精液冷凍保存有助于通過人工授精進行遺傳改良，消除人工授精應用中的地理障礙，保證瀕危品種的保存，從而保護生物的多樣性[1]。然而，精液冷凍過程會引起精子的超微結構和生化功能改變，尤其是精子質膜和染色質受損，精子膜通透性增加，產生活性氧（ROS）并發生脂質過氧化反應（LPO），導致精子活力降低、DNA 斷裂、細胞凋亡，影響精子的受精能力和早期胚胎的發育[2]。

原花青素（Proanthocyanidin，PC）是一種來自葡萄籽提取物的多酚生物類黃酮，能有效清除多種ROS和自由基，有效地抑制脂質過氧化，使細胞免于氧化損傷[3]。研究表明，PC 通過其抗氧化活性防止小鼠腦細胞中乙醇誘導的DNA 損傷[4]，并防止小鼠肝臟細胞（Fao）中H2O2誘導的DNA 損傷，減少氧化應激，并增強硫酸鎳誘導的大鼠睪丸中的精子活力[5]。吐魯番黑羊能夠適應吐魯番盆地惡劣的炎熱干旱多風沙氣候，且在粗纖維多、木質化強的牧草環境中能快速生長發育，是新疆優良地方綿羊品種之一[6]。開展吐魯番黑羊精液冷凍保存研究可充分提高其優良種公畜的利用率，并為自主培育優秀種公羊提供豐富的遺傳資源。因此，本實驗通過在吐魯番黑羊精液冷凍過程中添加不同濃度的PC，研究其對吐魯番黑羊冷凍精液的保護作用，通過檢測精子的品質來證明添加PC 對吐魯番黑羊精液冷凍保存技術的影響，為今后綿羊精液冷凍技術在實際生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原花青素購自源葉生物公司；葡萄糖、檸檬酸、Tris 購自Sigma 公司；青霉素鈉、硫酸鏈霉素購自Amresco 公司；過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；姬姆薩染色試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）染色試劑盒購自Genmed 公司。

1.2 主要儀器設備 酶標儀iMark 購自美國Bio-Rad 公司；離心機5424 購自德國Eppendorf 公司；計算機輔助精子分析系統（CASA，田園奧瑞，2001532）；倒置顯微鏡IX71 購自Olympus 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 稀釋液配制 基礎稀釋液（I 液）：Tris 3.04 g、無水葡萄糖1.136 g、無水檸檬酸1.554 g、青霉素1 000 IU/mL、鏈霉素1 000 IU/mL，去離子水溶解定容至100 mL，調整pH 為7.2，4℃冰箱保存備用?；A稀釋液（II 液）：Tris 3.0 g 葡萄糖6.0 g、檸檬酸1.7 g、青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1 000 IU/mL，去離子水溶解定容至100 mL，調整pH 為7.2，0.22 μm 濾頭過濾后置于4℃冰箱保存備用。對照液III 液為法國卡蘇商品化稀釋液OPtidyl（REF：020996，500 mL）。I 液和II 液采用一步法稀釋。先配制基礎液，消毒過濾后再添加20%的卵黃、6%甘油，配制成精液冷凍稀釋液。

1.3.2 實驗動物 實驗羊選取新疆吐魯番地區托克遜縣徽商生態牧業有限責任公司的性欲旺盛且繁殖性能高、體型外貌良好、睪丸大小適中，并經受過人工假陰道采精調教的10 只2～3 歲的純種吐魯番黑羊公羊。

1.3.3 精液采集 用假陰道法采集精液，每只公羊每隔1d 采精2 次，采集后20min 內到實驗室進行質量評價。選擇精液密度為2.5×109個/mL 以上，活率0.75 以上的方可用于試驗。將檢測合格后至少3 頭公羊的精液混合均勻，以消除個體差異，放入滅菌試管中備用。

1.3.4 精液處理 精液常規檢查后，在25℃室溫環境下用3 種不同稀釋液進行6 倍等溫稀釋。隨即將每組平均分成5 份，分別裝在15 mL 滅菌離心管中，在3 種冷凍稀釋液中分別添加0、5、15、25、35 μg/mL 5 種不同濃度的PC，共15 管。將精液與冷凍稀釋液混合均勻后快速用口吸法分裝到0.25 mL 細管中、封口粉封口，8 層紗布包裹并放入4℃冰箱進行平衡，3 h 內緩慢降溫至4℃。

1.3.5 精液冷凍及解凍 將平衡后的冷凍細管置于凍精碼架上，使低溫溫度計探針與碼架相連并保持同一高度，向泡沫盒中倒入液氮，低溫溫度計顯示溫度在-80～-120℃，凍精碼架與液氮面距離為3.5 cm，在液氮蒸氣中熏蒸8 min 后，將冷凍細管投入液氮中，按照組別裝到指型管中進行保存。解凍時，將冷凍細管投入37℃水浴孵育30 s。

1.3.6 精子活率及運動速率檢測 精子活率及運動參數利用計算機輔助精子分析系統（CASA）進行檢測，將紅寶石計數板置于精子分析儀37℃恒溫載物臺上預熱，取10 μL 精液滴在計數板中，每個樣品觀察5 個視野，自動測定精子活率和曲線運動速率（VCL）、直線運動速率（VSL）、線性度（LIN）、平均路徑速度（VAP）、頭部側移幅度（ALH）及振動指數（WOB）等運動參數。

1.3.7 精子畸形率檢測 采用姬姆薩染色法評價精子畸形率。取10 μL 解凍后精液滴于載玻片一端，均勻抹片，自然風干，中性福爾馬林固定液固定15 min 后清水沖去固定液，自然風干。將抹片反扣裝有吉姆薩染色的染色槽上，使抹片接觸染液，1.5 h 后清水沖去染液，自然風干待檢。每個樣品制作2 個抹片，每個抹片觀察200 個以上精子，并取2 個抹片的平均值。精子畸形一般分為頭部異常、頸部異常、尾部異常和頂體異常4 類。

精子畸形率=（畸形精子數/精子總數）×100%

1.3.8 精子質膜完整率檢測 采用Hypo-osmotic swelling test（HOST）方法檢測精子質膜的完整性。精子尾部發生彎曲形成圓環則為精子質膜完整的精子，而質膜受損的精子則不會形成圓環。將精液樣品解凍后600×g、4℃離心3 min，棄上清，PBS 重復清洗4 次，取10 μL 精子加入100 μL HOST 液（0.9 g 果糖和0.49 g 檸檬酸鈉溶于100 mL 去離子水）中，37℃混合孵育30 min，取10 μL 滴片，200×相差顯微鏡下觀察統計發生彎尾的精子數，共統計400 個精子。

精子質膜完整性=彎尾的精子數／400×100%。

1.3.9 精子頂體完整率 采用花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）檢測精子頂體完整性，具體操作參照GMS14015.1.1 說明；400×熒光顯微鏡下拍照觀察并計數約200 個精子，觀測到頂體發出綠色熒光的即為頂體完整的精子。

1.3.10 精子抗氧化指標檢測 CAT、T-AOC、GSH-Px含量嚴格按照試劑盒說明測定，隨即用酶標儀進行檢測。

1.4 統計分析 數據采用WPS 2019 進行整理，用SPSS 23.0 軟件對試驗所得數據進行單因素方差分析數據顯著性分析，結果用平均值± 標準誤來表示，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同釋液中添加PC 對吐魯番黑羊精液冷凍前后活率、畸形率和運動參數的影響 由表1 可知，各組在冷凍前的活率和畸形率差異不顯著。冷凍后，I 液15 μg/mL PC 組精子活率最高73.307%，顯著高于III 液15 μg/mL組，極顯著高于其他13 組。冷凍后，I 液15 μg/mL 組畸形率最低（9.845%），與III 液15 μg/mL 組、III 液25μg/mL 組和I 液5 μg/mL 組、I 液25 μg/mL 組無顯著差異，極顯著高于其他各組。由表2 可知，冷凍后I 液15 μg/mL組的VCL、VSL、LIN、VAP、ALH、WOB等指標均極顯著高于其他組。綜合冷凍前后活率、畸形率和運動參數等指標，I 液5 μg/mL 組、I 液15 μg/mL 組、II 液15 μg/mL 組、III 液15 μg/mL 組、III 液25 μg/mL組精液冷凍效果較好，可作進一步檢測以確定最佳冷凍配方。

表1 不同稀釋液添加PC 對精液冷凍前后活率和畸形率的影響

表2 不同稀釋液添加PC 對精液冷凍后運動參數的影響

2.2 不同釋液添加PC 對精液冷凍后質膜完整性的影響由圖1 可知，I 液15 μg/mL 組的質膜完整率極顯著高于I 液5 μg/mL 組，顯著高于II 液15 μg/mL 組、III 液25 μg/mL 組，與III 液15 μg/mL 組無顯著差異。

圖1 PC 凍融后精子質膜完整率

2.3 不同釋液添加PC 對精液冷凍后頂體完整性的影響由圖2 可知，I 液15 μg/mL 組頂體完整率顯著高于II液15 μg/mL 組，與其他組無顯著差異。

圖2 PC 凍融后精子頂體完整率

2.4 不同釋液添加PC 對精液冷凍后CAT、GSH-Px、T-AOC 活性的影響 由表3 可知，I 液15 μg/mL 組CAT酶活性顯著高于II 液15 μg/mL 組，與其他3 組無顯著差異。I 液15 μg/mL 組GSH-Px 活性高于III 液15 μg/mL組、III 液25 μg/mL 組、II 液15 μg/mL 組（P＜0.01）和I液5 μg/mL 組（P＜0.05）。I 液15 μg/mL 組T-AOC 含量最高，極顯著顯著高于I 液5 μg/mL 組、II 液15 μg/mL組和III 液15 μg/mL 組（P＜0.01），與III 液25 μg/mL組無顯著差異。

表3 不同釋液添加PC 對精液冷凍后CAT、GSH-Px、T-AOC 活性的影響

3 討 論

精液在冷凍-解凍過程中處于離體狀態，與外界空氣接觸使精液中氧含量升高而產生過量的ROS，并發生脂質過氧化反應而破壞精子膜的結構與功能完整性，導致精子抗氧化能力、運動性能、活力下降，從而影響精子的受精能力[7]。因此，在精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的抗氧化劑能及時清除細胞內部的ROS，提高精子冷凍-解凍過程中的抗氧化能力，有效保護精子免受脂質過氧化損傷[8]。PC 是一種天然的抗氧化劑，具有較強的抗氧化活性，可以有效清除超氧陰離子自由基（O2-）和羥基自由基（-OH），可以參與花生四烯酸和磷酸的代謝以及蛋白質的磷酸化，使脂質避免過氧化損傷[9]。

本研究結果表明，在稀釋液中添加PC 可提高凍融后的吐魯番黑羊精液質量和抗氧化能力。線粒體是細胞的主要能量供應場所。線粒體通過氧化磷酸化和ATP的合成作用在維持正常的精子功能和能量穩態方面發揮重要作用[10]。精液冷凍后會破壞精子的線粒體功能并刺激精子產生過量的ROS，過量ROS 導致精子的抗氧化防御系統失靈，致使精子進入氧化應激狀態[11]。ROS 還通過其脂質過氧化物MDA 直接氧化精子DNA堿基或與DNA 的共價鍵，從而導致細胞凋亡的發生[12]。然而，本實驗結果表明，與空白對照組相比，在精液稀釋液中添加不同濃度的PC 均能顯著提高凍融后精子的運動速率、活率、質膜完整性、頂體完整性，且在I 液中添加15 μg/mL PC 時效果最好，當添加量到達35 μg/mL 時精子的活率和畸形率開始降低，與空白對照組之間無顯著差異。這一結果與Wen[13]等在山羊精液低溫保存中添加葡萄籽原花青素所得結果類似，但山羊精液低溫保存中所需添加濃度略高，添加最佳濃度為30 μg/mL，當超過50 μg/mL 精液品質開始降低。呂松潔等[14]研究發現，當PC 添加量為10 μg/mL 時能顯著提高湖羊凍融精子的質膜完整率和頂體完整率。另有研究表明，豬精液冷凍稀釋液中添加30 μg/mL 和40 μg/mL 的葡萄籽原花青素可提高凍融后精子頂體完整率、線粒體活性和質膜完整率[15]。本研究中，在凍精稀釋液中PC 的添加量為15 μg/mL 時能極顯著提高精子質膜完整率，顯著提高頂體完整率，但當添加量到達35 μg/mL 時頂體完整率和質膜完整率開始降低，說明當添加PC 濃度超過一定范圍時，反而會破環精液品質。這可能是由于PC在精子脂膜中的作用與膽固醇的作用相似，通過脂膜的調節作用使細胞膜的穩定性增強，維持細胞膜的結構和功能的完整性，從而起到改善凍融精液品質的作用[16]。

精液冷凍保存過程中會產生過量的ROS，ROS 促進脂質過氧化，CAT 和GSH-Px 是精漿中內源性抗氧化劑，在氧化防御系統中起到清除自由基和維持細胞內氧化還原的作用[17-18]。本研究發現，在I 液中添加15 μg/mL PC 可顯著提高CAT、GSH-Px 活性，在III液中添加25 ug/mL PC 時T-AOC 含量最高，說明PC在綿羊精液冷凍保存中具有較強的抗氧化作用，這與孫艷青[15]和胡亞美[19]在豬精液冷凍保存和常溫保存中使用PC 的研究結果相一致。Long 等[17]研究表明PC 有效地防止了玉米赤霉烯酮（ZEN）誘導的氧化應激，改善了SOD 和GSH-Px 活性，降低了睪丸中MDA 含量。Li[20]等在公豬精液稀釋液中添加PC，精液在保存過程中減少了ROS 的產生，從而改善精子線粒體活性，提高了T-AOC 水平和公豬精子活力。綜上，PC 可以增強抗氧化酶的活性，降低氧化損傷，這應該是與PC 含有對抗ROS 和氧化應激作用的活性化合物有關，但PC對綿羊精液冷凍保存起保護作用的機制遠遠比抗氧化性復雜，具體的機理還尚未確切，需通過科學試驗來進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明，在吐魯番黑羊精液冷凍過程中添加PC 能顯著提高冷凍-解凍后的精液質量與抗氧化能力，以I 液添加15 μg/mL PC 組效果最佳。