脂肪來源間充質干細胞治療免疫性皮膚病研究進展

何玉倉 吳含文 楊芳芳 丁思琦 李力群

免疫性皮膚疾病大部分發病原因不詳，治療困難，長年的疾病進程常會給患者生活、心理上造成巨大負面影響。近年來間充質干細胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）移植在免疫性皮膚病治療中的應用備受關注。MSCs是一類可以從人體多個部位獲得的多向分化潛能的干細胞，其具有強大的自我更新能力，可以分化為不同組織類型[1]，現今被廣泛研究而應用于組織工程。其中的脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs）相比較于其他干細胞而言，具有來源豐富、取材簡單、便于培養、增殖速度快、免疫原性較低等顯著的優越性，越來越受到人們的關注[2]。大量的體外和體內實驗都證實它們具有強大的抗炎、抗纖維化、抗凋亡和促血管生成作用。ADSCs通過分泌抗炎細胞因子來調節免疫系統，發揮協同作用，使ADSCs移植后的組織修復能力增強，細胞損傷減少[3]。它們所表達的Ⅰ類主要組織相容性復合體，在炎癥等情況下可以被誘發表達Ⅱ類主要組織相容性復合體[4]。并且由于人類白細胞抗原（HLA）-DR和共刺激分子如CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40及其配體CD40L在其表面的表達缺失，使其具有免疫逃避機制[5-6]。各種免疫調節的機制使ADSCs在再生醫學方面之外，有了更廣闊的用途——免疫性皮膚疾病的治療。

1 ADSCs的免疫調節功能

ADSCs主要通過兩種途徑發揮免疫調節功能。一種是直接的，通過MSCs與包括免疫細胞在內的多種細胞間的相互作用發揮免疫調節的作用。ADSCs可以作用于包括T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞在內的免疫細胞、內皮細胞、前脂肪細胞、造血細胞、神經細胞、周細胞和血管周圍的內皮細胞等多種細胞進而發揮免疫調節功能[7]。不僅是有生物活力的MSCs、凋亡的MSCs，甚至MSCs碎片也可以發揮部分的抗炎效應[8]。另一種是間接的，ADSCs分泌多種可溶性介質以及細胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs），作用于靶點來達到減輕炎癥反應的目的[9]。這些EVs是由營養物質和前炎癥因子組成的，包括了細胞因子、趨化因子、甚至由EVs運載的蛋白質以及miRNAs，EV包括外泌體和微囊泡，可以作為膜與胞漿蛋白、脂質和遺傳信息之間轉移的載體在細胞之間的通信中發揮作用[10-12]。目前認為，非直接細胞接觸是ADSCs發揮免疫抑制效應、促進組織修復再生的主要途徑[13]，利用MSCs分泌效應的治療方法最近也受到越來越多的關注。

2 ADSCs在自身免疫性皮膚病的應用

目前應用ADSCs治療自身免疫性皮膚疾病的方法有局部給藥和全身給藥。全身給藥的操作簡單，常常通過ADSCs靜脈注射來實現。ADSCs進入體內后根據局部促炎細胞因子表現出高度的趨化性，定位于炎癥組織，可能和ADSCs表達的趨化因子受體4（CXCR4）有關[14]。雖然ADSCs靜脈注射的安全性在一期人類臨床試驗中已經得到肯定[15]，但其存在的其他風險仍未完全明確。局部給藥包括皮內注射、混合移植等[16]，具有高效、精準，直擊靶點的優點，在實際應用中更具優勢。但針對很多全身散在病灶的皮膚病患者而言，局部給藥會增加更多痛苦，無法達到根治效果。因此如何選擇用藥要視患者和疾病本身特點來選擇。

2.1 ADSCs用于治療系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE） SLE是由于免疫復合物沉積造成全身多器官受損的自身免疫性疾病，抗核抗體(ANA)和抗雙鏈DNA常作為懷疑SLE或結締組織疾病患者的篩選工具[16]。產生IL-17的Th17細胞在小鼠模型中被證實是SLE等多種自身免疫性疾病的促進因素[17]。研究者發現通過ADSCs靜脈注射后可以控制Th17淋巴細胞數量和產生IL-17的能力來實現免疫調節，還可以減少Th1、增加Breg細胞、Treg細胞的數量，減輕SLE小鼠蛋白尿和血清的抗ds-DNA抗體、肌酐，減輕腎臟損害以及腎間質的炎性細胞浸潤和水腫，改善SLE的炎癥指標和臨床癥狀[19-21]。ADSCs的應用就調節Th17/Treg平衡比例上來看，和SLE傳統治療用藥環磷酰胺作用效果無統計學差異[22]，這有可能為SLE的治療提供新方向。

2.2 ADSCs用于治療特應性皮炎（atopic dermatitis,AD） AD是一種和遺傳因素、環境過敏原有關，伴有表皮屏障破壞的多因素、異質性疾病，可伴有炎癥反應，以皮膚瘙癢為主要臨床表現。AD患者血清IgE水平增高，急性期皮損處Th2細胞顯著增高，產生細胞因子如IL-4、IL-13、IL-31等，慢性期可發現Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ升高[23-24]。有學者在犬AD模型中通過系統性注射ADSCs治療6個月后，原先經過傳統治療（如食譜營養支持、局部治療、抗菌藥物治療、過敏原特異性免疫治療、免疫調節藥物等）12個月以上無效的病犬的瘙癢程度（1周改善）和犬類AD評分（1月改善）都有顯著改善[25]。在NC/Nga小鼠AD模型病變區域內注射自體ADSCs或者自體ADSCs培養基，也能顯著減輕小鼠體內炎癥因子表達水平和皮損表現[26]。研究表明，局部注射可以誘導神經酰胺和二氫神經酰胺的產生，同樣可以減少經表皮水分流失，同時增強角質層水化，顯著降低炎性細胞因子水平，并且呈劑量依賴性，進而修復破損的皮膚屏障和抑制皮膚炎癥。

2.3 ADSCs用于治療銀屑病 銀屑病是一種全身性的、免疫介導的疾病，以皮膚和關節炎癥為特征的疾病[27]。銀屑病的發病可能和T淋巴細胞在表皮浸潤有關，包括Th1和目前認為起關鍵作用的Th17[28]。T淋巴細胞可以釋放刺激角質形成細胞增生的細胞生長因子IL-17 、IL-22、IFN-γ、TNF-α等[29]，使得銀屑病患者皮膚MSCs對T細胞增殖的抑制能力減弱。而在編碼Th1和Th17細胞因子的大部分基因中有相對更高的表達，所以有觀點認為MSCs異?？赡苁倾y屑病的發病因素之一[30]。2016年，有研究者嘗試在1例尋常型銀屑病患者和另1例銀屑病關節炎患者靜脈注射自體ADSCs，進而發現2例患者的銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）分別都得到了改善。尋常型銀屑病患者TNF-α略有降低，并且與銀屑病臨床癥狀有關的活性氧濃度也顯著降低[31]。無獨有偶，另一研究使用富含ADSCs的基質血管碎片單獨治療難治性銀屑病患者，經過單次靜脈注射后，患者在1個月后銀屑病斑塊便得到了極大的改善，銀屑病面積和嚴重程度指數評分由基線時的50.4分，在1個月后降至0.3分。12個月內無嚴重不良事件發生[32]。

2.4 ADSCs用于治療系統性硬化癥系統性硬化癥（systemic sclerosis,SSC） SSC也叫硬皮病，是一種免疫介導的風濕性疾病，其特征是膠原和其他基質成分在皮膚和靶器官中的積累導致的皮膚和臟器的纖維化以及血管病變。SSC的早期階段，細胞浸潤主要由Th2型細胞組成，同時伴隨血清中TGF-β、血小板源性生長因子和IL-1水平的顯著增加，增強炎性反應[33]。研究者在次氯酸誘導的SSC小鼠模型中靜脈注射自體ADSCs或人ADSCs后均可看到皮膚厚度減少，Ⅰ型膠原（Col1）、α-SMA轉錄表達以及皮膚和肺部膠原含量減少。值得注意的是，在減少皮膚纖維化方面，ADSCs注射比骨髓來源的MSCs注射效果更為顯著[34]。同時在博來霉素誘導的SSC小鼠模型中，靜脈注射ADSCs也可以使皮膚和肺的纖維化減輕；CD4+、CD8+T細胞和巨噬細胞向真皮的浸潤減少；皮膚中膠原蛋白和成纖維細胞因子IL-6、IL-13等的mRNA表達減少[35]。另外，通過離心提取富含ADSCs的SVF局部注射治療SSC手部病變患者時，患者皮膚纖維化，手部水腫，生活質量明顯改善，31.6%的活動性手部潰瘍在注射后24周愈合，甲襞毛細管顯微鏡半定量結果得到改善[36]?？偟膩碚f，ADSCs在SSC的治療中，可能通過限制細胞外基質蛋白和增加膠原酶活性來減少纖維化；通過調節基礎的肥厚性瘢痕成纖維細胞的細胞外間質重塑；并通過干細胞增殖和分化提供結構支持[37]。

2.5 ADSCs用于治療天皰瘡 天皰瘡的發病與針對角質形成細胞黏附分子的自身抗體IgG的產生相關。自身抗體與黏附分子橋粒芯蛋白Ⅰ、橋粒芯蛋白Ⅲ的結合會破壞角質形成細胞的細胞內黏附力，導致棘皮松解和天皰瘡中常見的病灶，包括水皰和表皮內膿皰的形成[38]。常見的治療天皰瘡的方法存在較多不良反應，尤其是治療后的低存活率[39]。2015年有學者報道了1例在使用激素或免疫抑制劑無效的落葉型天皰瘡病犬模型中，經過20個月共21次的ADSCs靜脈注射治療，病犬的激素使用量逐漸下降，皮損改善，并且在ADSCs治療結束后12個月的低劑量潑尼松龍維持治療中基本無新發皮損[40]。由此提示ADSCs應用可作為輔助治療天皰瘡的新思路，在緩解天皰瘡引起的皮膚損傷中具有重要意義。

2.6 ADSCs用于治療白癜風 白癜風是一種臨床上常見的后天性局限性或泛發性皮膚色素脫失性疾病，任何部位皮膚均可發生，但好發于受光照和摩擦損傷部位，如面頸部、軀干部和四肢等部位。其始發因素是各種原因造成的黑素細胞破壞[41]。經過長期研究發現，大量的CD8+T淋巴細胞浸潤在白癜風皮損真皮淺層內[42]，并具有黑色素細胞抗原特異性，可以針對性地殺傷黑色素細胞，從而指導角質形成細胞不可逆的凋亡，造成正常皮膚色素減退。這也是導致白癜風發病的可能機制之一。因此如何抑制白癜風皮損周圍浸潤的CD8+T淋巴細胞，有效調節皮損周圍的免疫環境，將成為治療白癜風的有效手段。Kim等[43]發現與ADSCs共同培養的黑素細胞相比較而言，其向表皮遷移的數量明顯增加。這可能與ADSCs可以促進堿性成纖維細胞生長因子、干細胞生長因子分泌等有關[44]。Lim等[45]將不同比例的原代培養的人ADSCs和原代培養的人黑色素細胞移植到SD大鼠和裸鼠中取得良好效果，進一步證實了ADSCs聯合治療膚色恢復的安全性及持久性。這為白癜風治療提供了一種更有效的新療法。

2.7 ADSCs用于治療免疫性脫發 免疫性脫發是由于反應性T細胞的過度活化,毛囊自身免疫赦免的破壞[46-47]引起自身免疫系統攻擊毛囊組織，發生脫發。治療免疫性脫發的傳統藥物主要為米諾地爾和糖皮質激素類。米諾地爾通過擴張血管、刺激毛囊真皮乳頭細胞,促使毛囊進入生長期。糖皮質激素具有免疫抑制的作用,減少免疫細胞對毛囊的攻擊，促進毛囊的正常生長。但這兩種藥物均有明顯的不良反應,臨床應用具有局限性。有學者將ADSCs和毛囊真皮乳頭細胞（DPCs）共培養發現ADSCs可以有效促進DPCs的增殖能力,增強DPCs的分泌功能及DPCs誘導毛囊形成的能力，促進毛囊進入生長期[48]。同時在免疫性脫發小鼠模型中,經ADSCs混合培養基注射治療，小鼠毛發質量增加,毛發生長情況改善，免疫組化顯示ADSCs可以下調毛囊周圍的免疫功能,降低局部炎癥因子水平[49]。國外也有研究通過隨機對照實驗驗證ADSCs治療的安全性[50-51],結果顯示無嚴重不良反應發生。ADSCs的應用為治療免疫性脫發提供良好理論依據和實驗基礎。

3 小結

自身免疫性皮膚疾病的治療始終是個亟待研究的難題。目前傳統的治療方案包括糖皮質激素和免疫抑制劑，以對癥治療、延緩病情進展為主。近年來生物制劑也被廣泛研究和應用。但是無論是哪種方案，都存在長期使用后不良反應大、成本高昂、易復發等缺點。ADSCs同時具有免疫調節效應與再生作用，在創傷、腫瘤、糖尿病等物理因素造成的皮膚創面修復方面應用價值得到了認同，對于自身免疫性皮膚病的治療也存在很大潛力。ADSCs的免疫調節作用涉及T細胞、B細胞、單核細胞和NK細胞等，控制免疫細胞的炎癥狀態，促進免疫細胞產生抗炎細胞因子。ADSCs也可以通過旁分泌功能——分泌可溶性介質和EVs，達到免疫調節的目的。

目前，ADSCs體外誘導和分化技術已經十分成熟，而在生物體內移植后的成活時間卻是個難以解決的問題。有研究表明，通過靜脈輸注ADSCs后，經由接受者的免疫系統抵抗，ADSCs難以在損傷組織維持一個長時間的移植狀態[64]。雖然ADSCs也可以分泌可溶性分子達到免疫調節目的，但是往往在幾天以后便難以在組織中檢測到。并且，由于其固有的生物特性和多樣分化的能力，ADSCs是否具有潛在致瘤可能仍未有明確答案。但總的來說，ADSCs在免疫性皮膚病中具有良好的應用前景，值得進一步研究。