分光光度法對再生蛋白質纖維中蛋白質含量的測定

王亞妮，李莉萍，張陽，張敏莉

(寶雞市質量技術檢驗檢測中心，陜西寶雞721013)

0 前言

再生蛋白質纖維是區分于蠶絲、羊毛等天然蛋白質纖維，利用高科技方法制造出的富含蛋白質的纖維。一般情況下，先由含有蛋白質的動植物中提煉出蛋白質溶液，然后將其與其他高聚物共同接枝或共混復合而成[1]。國外研究可追溯到19世紀60年代，而在我國，上世紀末才開始對其進行研究及開發利用。目前，再生蛋白質纖維品種繁多，比如大豆蛋白纖維、牛奶蛋白纖維、蠶蛹蛋白纖維和玉蠶蛋白纖維等，其中大部分都已經規?；a，普遍應用于日常生活中。由于其富含蛋白質而深受消費者的青睞，蛋白質的優良特性也使得蛋白質含量成為蛋白質纖維性能的重要指標。然而，目前此類產品蛋白質含量的檢測標準以及檢測方法研究甚少，標準體系還不健全，消費者無法很好地了解產品性能，維護自身權益。因此，研究更優化、更準確的檢測方法是目前迫切需要解決的課題。

本文把分光光度法應用于再生蛋白質纖維的蛋白質含量檢測，通過對試驗條件的探索，影響因素的分析，數據的對比，形成更優化、更易于推廣的再生蛋白質纖維中蛋白質含量檢測的試驗方法。

1 方法原理

根據國家標準GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》，再生蛋白質纖維中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸生成硫酸銨，在pH為4.8的乙酸鈉和乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3，5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400 nm的環境下測定其吸光度值，與標準系列比較定量，結果乘以換算系數，即為所含蛋白質質量分數。

2 試驗部分

2.1 樣品

試驗樣品有質量分數為100%的羊毛及蠶絲，牛奶蛋白纖維（乙烯醇基）、牛奶蛋白纖維（丙烯腈基）、大豆蛋白纖維（乙烯醇基）和蠶蛹蛋白纖維（黏膠基）。

2.2 主要試劑

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉（質量濃度300 g/L）、對硝基苯酚指示劑溶液、乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、氨氮標準使用溶液、質量分數為37%的甲醛、乙酰丙酮（以上均為分析純）。

2.3 儀器設備

紫外分光光度計、石墨消化儀、恒溫水浴鍋（100±0.5）℃、天平、10 mL具塞玻璃比色管、容量瓶（100 mL、50 mL）、刻度吸管。

2.4 測試

2.4.1 樣品前處理和消化

樣品的前處理依據GB/T 2910.1—2009《紡織品定量化學分析第1部分：試驗通則》中8.2規定的方法進行。稱取一定量處理過的混勻的試樣（精確至0.001 g）于消化管中，加入一定量的硫酸銅、硫酸鉀和硫酸，在石墨消化儀中進行消化處理一段時間，直至液體呈藍綠色透明狀，再加熱一段時間，取下冷卻，慢慢加入少量的水，放冷后轉移至100 mL容量瓶中，定容，在此消化過程中同時進行空白試驗。

2.4.2 標準曲線繪制以及樣品測定

吸取5.0 mL試樣及試劑空白消化液于50 mL容量瓶內，加入1～2滴對硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻、備用。然后繪制氨氮標準曲線，同時吸取2.0 mL上述試樣溶液和同量的試劑空白溶液于10 mL比色管中，加乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及顯色劑，混勻，置于沸水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，于波長400 nm處測量吸光度值，試樣吸光度值與標準曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。

2.4.3 計算公式

含量測定的計算公式見式1。

式中：w——試樣中蛋白質的質量分數，%；

m1——試樣測定液中氮的質量，μg；

m0——試劑空白測定液中氮的質量，μg；

m——試樣質量，g；

100——換算系數；

F——氮換算為蛋白質的系數。

2.5 比對方法

2.5.1 次氯酸鈉法

2.5.2 凱氏定氮法

凱氏定氮法是經典的檢測蛋白質含量的成熟方法，其起初是檢測乳制品、食品類產品蛋白質含量最常用方法之一，后被應用到其他檢測領域。凱氏定氮法試驗依據FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質含量試驗方法》中方法A來測試樣品中蛋白質含量，差異在于其使用全自動凱氏定氮儀法進行測試。所用儀器為Kjeltec 8200型福斯自動凱氏定氮儀。

3 結果與討論

3.1 分光光度法測試影響因素

3.1.1 樣品

再生蛋白纖維由于其特殊的成絲原理，一般選擇一種基體作為依托，融合蛋白質液來紡絲，最終呈現出蛋白質和基體材料兩種特性。目前成絲所用的基體大多為黏膠、聚乙烯醇和聚丙烯腈等高聚物。比如，黏膠基的蠶蛹蛋白黏膠纖維、聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維等。而按照分光光度法試驗原理，此方法會檢出樣品中所有的含氮原子，對于聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維，此方法檢出的蛋白質含量還包含了聚丙烯腈里的氮原子，最終會導致蛋白質含量檢出值偏高。牛奶蛋白纖維含量測試結果見表1。

表1 牛奶蛋白纖維測試結果

表1中的牛奶蛋白纖維為兩種：一種是聚丙烯腈基的牛奶蛋白纖維；另一種是乙烯醇基的牛奶蛋白纖維。前一種為質量百分比為30%的牛奶蛋白纖維和70%棉纖維的混合物，后一種為純牛奶蛋白纖維，用3種不同的檢測方法對其進行檢測。結果顯示，對于丙烯腈基的牛奶蛋白纖維，用分光光度計法和凱氏定氮法檢出的蛋白質含量偏高；對于乙烯醇基的牛奶蛋白纖維，3種方法檢測結果則無明顯差異。因此，在蛋白質含量檢測時，了解樣品的結構以及特性是首要任務，是選擇合適正確方法的前提。

3.1.2 消化時間與消化溫度

本試驗中，選擇用石墨消化儀來消化試樣，既批量化又安全且節約時間，但合適的消化溫度和準確的消化時間是關鍵因素。依據硫酸的沸點，試驗中起初選擇消化溫度為400℃，消化時間1 h時，觀察消化液成淺黃色，消化不完全；消化溫度不變，延長消化時間，不斷觀察直至時間為2 h時，消化液成藍綠色并且澄清透明，消化完全。但消化液放涼后，發現存在消化液結塊現象，且同一樣品測定結果值差異較大。調整消化溫度為420℃，隨著消化時間增加，觀察消化液變化，直至消化時間為1.5 h時，消化液成藍綠色且澄清透明，消化完全，且放涼之后消化液整體呈溶液狀態，同一樣品測定結果值也較穩定。

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3.1.3 水浴加熱溫度

試驗中水浴加熱時間為15 min的過程中，水浴的溫度對試驗成功與否起決定性作用。當水浴鍋的溫度不能持續保持在沸騰狀態時，15 min之后拿出比色管放涼，比色管里的溶液較渾濁，用分光光度計進行比色，同一樣品整體數值偏高，精密度結果偏差大。但是，當水浴鍋溫度持續保持在沸騰狀態時，加熱15 min之后的比色管里溶液澄清透明，同一樣品的數值穩定，精密度結果良好。所以在試驗中，為了確保試驗結果的準確性，一定要控制好水浴溫度，必須保持在持續沸騰的狀態。

3.1.4 氮換算為蛋白質系數

氮元素在所有蛋白質中含量較為穩定，約占16%[2]，分光光度法就是利用蛋白質中氮元素的含量來測蛋白質含量。所以在2.4.3中的計算公式（1）中，要乘以F（氮換算為蛋白質系數）值計算出最終的蛋白質含量。而氮換算為蛋白質的系數雖是一個常數，但在不同的物質中有所差異，比如在大豆蛋白制品中一般為6.25，在純乳與乳制品中為6.38，這些數值參考食品標準中蛋白質的折算系數，對于再生蛋白纖維中蛋白質含量的折算是否準確不得而知。本文依據FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質含量試驗方法》中的規定，再生蛋白質纖維氮換算系數為6.25。但對于羊毛、蠶絲等蛋白質纖維，沒有準確可參考的數值，本試驗則是通過次氯酸鈉法比較試驗分析，最終得出羊毛氮換算系數為5.79、蠶絲氮換算系數為5.55。

3.2 三種方法的測試結果以及數據分析

用分光光度、凱氏定氮和次氯酸鈉分別測試羊毛、蠶絲、牛奶蛋白纖維（乙烯醇基）、大豆蛋白纖維和牛奶蛋白纖維中的蛋白質含量，測試結果見表2、表3和表4。

表2 分光光度法測試結果

表3 凱氏定氮法測試結果

表4 次氯酸鈉法測試結果

依據FZ/T 50018—2013《蛋白黏膠纖維蛋白質含量試驗方法》中的精密度的規定（在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對值不得超過算數平均值的10%，以大于算數平均值10%的情況不超過5%為前提），分析數據的精密度，符合標準要求。同時，計算各組數據的相對標準偏差，檢測結果的精密度良好。

3.3 與次氯酸鈉法、凱氏定氮法比較

為了判定3種方法之間的差異性，采用F檢驗法單因素方差分析對3種方法的測試結果進行檢驗，結果見表5。

表5 分光光度法、次氯酸鈉法和凱氏定氮法的比較

由表5可見，在置信區間95%下，計算出同一樣品3種不同方法的P值＞0.05，這說明3種方法測試的數據無顯著性差異。

4 結語

（1）分光光度法測試再生蛋白質纖維中蛋白質含量的原理實為全氮法，即檢出樣品中所有含氮元素的量。所以它同凱氏定氮法一樣存在局限性，不適合再生蛋白質纖維基體中含有氮元素的纖維，會導致蛋白質測定結果偏高。

（2）分光光度法試驗時，完全消化條件為消化溫度420℃、消化時間1.5 h，試驗中水浴溫度持續保持在沸騰狀態，加熱15 min。

（3）分光光度法較之次氯酸鈉法，影響測試結果的因素較少，抗干擾性小，結果較準確。次氯酸鈉法受次氯酸鈉濃度、溶解溫度和溶解時間等條件的影響較大。

（4）與凱氏定氮法相比較，分光光度法試劑用量少，操作簡單、安全環保。同時，分光光度計是每個實驗室最基本的檢測儀器，操作簡單，對人員要求不高，此方法更適合大范圍推廣。